ACE2通過下調(diào)AT1R和ERK1/2的磷酸化而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖

曹金龍，龔晶婧，許昌聲，王華軍，盧卓強(qiáng)，晉學(xué)慶

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建省高血壓研究所，福建福州 350005)

腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是一個(gè)復(fù)雜的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它與心血管疾病如高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)在RAS系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的病理生理學(xué)作用，AngⅡ可以通過其特異的血管緊張素Ⅱ1型受體(AngiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R)及其下游信號分子實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)作用，如AngⅡ可以通過細(xì)胞外基質(zhì)激 酶 (Extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)信號通路介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移等［2］，血管平滑肌細(xì)胞的增殖會(huì)導(dǎo)致血管壁增生肥厚，是高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的病理基礎(chǔ)。自從2000年Donoghue等［3］研究發(fā)現(xiàn)一種與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)是同源物質(zhì)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(Angiotensin-converting enzyme，ACE2)以后，這為RAS研究開辟一個(gè)新領(lǐng)域。ACE2與ACE的不同在于它是一種單羧基肽酶，可以水解AngⅡ生成Ang(1-7)，研究發(fā)現(xiàn)Ang(1-7)可以對抗AngⅡ介導(dǎo)的多種生物學(xué)作用［4］。雖然過去的研究發(fā)現(xiàn)ACE2可以作為一種重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子對抗AngⅡ介導(dǎo)的的多種心血管疾病的發(fā)生。然而，關(guān)于ACE2發(fā)揮作用的具體機(jī)制目前仍然不是十分清楚，本研究利用載有ACE2基因的慢病毒表達(dá)載體感染SD大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，研究ACE2的過表達(dá)對AT1R表達(dá)的影響，觀察 ACE2過表達(dá)對ERK1/2磷酸化水平的變化以及平滑肌細(xì)胞增殖的影響，以期進(jìn)一步闡明ACE2對平滑肌細(xì)胞增殖影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 SD成年大鼠(120～150 g)(福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)♀♂不限，慢病毒表達(dá)載體(Lentiviral-ACE2))和空載體慢病毒(Lentiviral-GFP)由上海Genechem基因技術(shù)公司協(xié)作構(gòu)建和擴(kuò)增;AngⅡ購自(美國，Sigma公司)，ACE2兔抗大鼠一抗、AT1R兔抗大鼠一抗購自(美國Abcam公司)、ERK1/2和p-ERK1/2兔抗大鼠一抗購自(美國CST公司)、β-actin小鼠抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗購自(美國Santa Cruz公司)，磷酸酶抑制劑Cocktail購自(美國 Invitrogen公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自(美國Gibco公司)，RIPA細(xì)胞裂解液(RIPA Lysis Buffer)，蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)，Cell Counting Kit-8(CCK-8 Kit)試劑購自(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的培養(yǎng)，采用組織貼塊法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞原代以及傳代培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定平滑肌細(xì)胞［5］。選用培養(yǎng)至第3代的平滑肌細(xì)胞，使用含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的完全培養(yǎng)液以5×104細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板。在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至孔底面積的0.5～0.6時(shí)，慢病毒以感染復(fù)數(shù)MOI為10感染平滑肌細(xì)胞不同時(shí)間并分組為:對照組、空載體組、感染24、48、72和96 h組;待細(xì)胞長滿6孔板底面積的0.80 時(shí)，AngⅡ以 10－7mol·L－1濃度分別孵育不同時(shí)間并分組為:對照組、3、6、9、12 和 15h 組;慢病毒感染平滑肌細(xì)胞96 h后，繼續(xù)加入AngⅡ孵育12 h后提取總蛋白，并分各干預(yù)組為:對照組、Lentiviral-GFP、AngⅡ、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2和Lentiviral-ACE2組;同樣慢病毒感染平滑肌細(xì)胞96 h后，相繼加入AngⅡ孵育5 min后提取總蛋白，并將各干預(yù)組分組為:對照組、AngⅡ、Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2和Lentiviral-ACE2組。

1.3 熒光顯微鏡觀察慢病毒綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞接種同上，將慢病毒(Lentiviral-GFP)以感染復(fù)數(shù)為10(multiplicity of infection，MOI=10)感染平滑肌細(xì)胞，感染12 h后換成新鮮的的完全培養(yǎng)液，共計(jì)培養(yǎng)96 h后，在熒光顯微鏡(放大倍數(shù)為×100)下觀察慢病毒綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)情況。

1.4 細(xì)胞增殖的測定 采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測平滑肌細(xì)胞增殖，利用細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原性與底物顯色可間接反映細(xì)胞數(shù)目。選用第3代平滑肌細(xì)胞，使用含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，光鏡下計(jì)數(shù)，以5×103細(xì)胞/孔接種于96孔板中且每孔體積定容為100 μl，并將各干預(yù)組分組為:對照組、Lentiviral-GFP、AngⅡ、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2 和Lentiviral-ACE2組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白背景組。以MOI=10將慢病毒感染細(xì)胞96 h后，隨后加入 AngⅡ(10－7mol·L－1)干預(yù) 24 h，然后每孔內(nèi)加入 CCK-8 增殖反應(yīng)液 10 μl，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h，在酶標(biāo)儀上450 nm處檢測其吸光度。

1.5 Western blot 采用常規(guī)Western blot法檢測ACE2、AT1R蛋白以及ERK1/2的磷酸化水平，待各組完成干預(yù)后，吸掉培養(yǎng)液，在6孔板內(nèi)各孔加2 ml 4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS 0.01 mol·L－1pH 7.4)或TBS緩沖液，重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞3次以洗去培養(yǎng)液。在各孔加入200 μl RIPA細(xì)胞裂解液(RIPA Lysis Buffer)(1 ml RIPA裂解液加10 μl PMSF(100 mmol·L－1)和 10 μl Cocktail磷酸酶抑制劑)，待細(xì)胞充分裂解后，提取總蛋白，采用BCA法對總蛋白進(jìn)行定量，取30 μg總蛋白進(jìn)樣于預(yù)灌制的7.5%聚丙烯酰胺凝膠中，電壓100 V、SDSPAGE電泳2 h，按1～2 mA·cm－2電流轉(zhuǎn)膜1.5 h將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，ACE2一抗(1 ∶1 000)、AT1R 一抗(1 ∶1 000)、ERK1/2和pERK1/2一抗(1∶2 000)、β-actin一抗(1∶2 000)4℃過夜、用含(1∶1 000)吐溫的Tris緩沖液(TBST，pH=7.4)洗膜3×10 min、然后在山羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h、TBST洗膜3×10 min，最后加入ECL發(fā)光劑、曝光、顯影和定影，采用Image J(1.44)軟件對特異性條帶進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染平滑肌細(xì)胞后目的蛋白的表達(dá)

如Fig 1所示，A圖是可見光視野，B圖為綠色熒光視野，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)，兩圖均可見綠色熒光蛋白。提示慢病毒表達(dá)載體能夠高效表達(dá)目的蛋白質(zhì)。如Fig 2所示，慢病毒感染平滑肌細(xì)胞不同時(shí)間后，ACE2蛋白的表達(dá)量呈時(shí)間依賴性增加，慢病毒感染平滑肌細(xì)胞24 h后ACE2蛋白的表達(dá)量開始增加，慢病毒感染細(xì)胞96 h ACE2蛋白表達(dá)量較對照和空載體比較均有明顯增加(1.23±0.06vs0.54±0.03和0.54±0.09，P＜0.05)，說明載有ACE2的慢病毒隨時(shí)間依賴性高效表達(dá)ACE2蛋白。

2.2 ACE2過表達(dá)對平滑肌細(xì)胞增殖的影響 如Fig 3所示，AngⅡ可以明顯促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖(0.68±0.03vs0.40±0.02，P＜0.05)。ACE2過表達(dá)后明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用與單用AngⅡ組比較(0.53±0.102vs0.68±0.03，P＜0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)單用Lentiviral-ACE2感染平滑肌細(xì)胞后有抑制平滑肌細(xì)胞增殖作用(0.26±0.06vs0.40±0.02，P＜0.05)。提示無論在有或無 AngⅡ孵育情況下ACE2均具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用。

Fig 1 Effect of lentiviral-GFP transfection on vascular smooth muscle cells(MOI=10)

Fig 2 ACE2 protein expression after gene transfection in vascular smooth muscle cells(n=4)

Fig 3 Effects of ACE2 gene transfection on VSMCs proliferation(n=4)

2.3 ACE2過表達(dá)對AT1R表達(dá)的影響 如Fig 4所示，AngⅡ(10－7mol·L－1)孵育平滑肌細(xì)胞不同時(shí)間后AT1R成時(shí)間依賴性上調(diào)，并且AngⅡ在作用12 h較對照組比較AT1R開始明顯升高(0.24±0.01vs0.12±0.01，P＜0.05)。如 Fig 5所示，ACE2對AngⅡ誘導(dǎo)的AT1R的上調(diào)與單用AngⅡ組比較有明顯抑制作用(0.34±0.07vs0.72±0.07，P＜0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)單用ACE2慢病毒感染平滑肌細(xì)胞較無AngⅡ干預(yù)組比較也具有下調(diào)AT1R作用，提示無論在有或無AngⅡ作用下，ACE2均可以下調(diào)AT1R。

Fig 4 Effects of angiotensinⅡon AT1R expression in vascular smooth muscle cells(n=4)

Fig 5 Effects of ACE2 overexpression on AT1R expression in vascular smooth muscle cells(n=4)

2.4 ACE2蛋白過表達(dá)對ERK1/2的磷酸化水平的影響 如Fig 6所示，AngⅡ孵育平滑肌細(xì)胞后ERK1/2的磷酸化水平明顯升高?？蛰d體慢病毒對AngⅡ誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化水平與單用AngⅡ組比較差異無顯著性，但ACE2過表達(dá)對AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化水平較單用AngⅡ組比較有明顯抑制作用(0.43±0.06vs0.71±0.08，P＜0.05)，同時(shí)載有ACE2基因的慢病毒感染平滑肌后有抑制ERK1/2的磷酸化(0.28±0.06vs0.39±0.04，P＜0.05)，提示ACE2過表達(dá)可以抑制ERK1/2的磷酸化水平。

*P＜0.05 vs control and GFP;#P＜0.05 vs AngⅡ and AngⅡ +GFP

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，ACE2蛋白過表達(dá)明顯抑制平滑肌細(xì)胞的增殖并且具有下調(diào)AT1R以及抑制其下游信號分子ERK1/2的磷酸化水平，提示ACE2抑制平滑肌細(xì)胞增殖可能是通過抑制AT1R的上調(diào)和ERK1/2的磷酸化水平而實(shí)現(xiàn)的。

Gurley等［6］的研究發(fā)現(xiàn)在ACE2基因敲除的小鼠模型研究中，ACE2缺陷的小鼠心血管功能發(fā)生嚴(yán)重紊亂，提示ACE2在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮有重要作用。國內(nèi)有研究報(bào)道，ACE2的升高可以改善心肌重塑［7］并且具有血管保護(hù)作用［8］，這些現(xiàn)象提示我們，研究ACE2在心血管系統(tǒng)中所發(fā)揮作用的具體機(jī)制，對于我們深入的了解腎素血管緊張素系統(tǒng)在心血管疾病中的作用以及指導(dǎo)心血管疾病的臨床治療具有重大意義。然而，國內(nèi)外對于ACE2抑制平滑肌細(xì)胞增殖及其相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究使用載有ACE2基因的慢病毒表達(dá)載體感染平滑肌細(xì)胞，觀察ACE2過表達(dá)對平滑肌細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步研究ACE2對AT1R的表達(dá)以及信號分子ERK1/2磷酸化影響，探討ACE2對平滑肌細(xì)胞增殖影響的可能機(jī)制。

首先，本研究進(jìn)一步證實(shí)AngⅡ具有促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的作用，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果相一致，如Dzau等［9］研究表明AngⅡ可以通過AT1R介導(dǎo)促細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)作用。另外發(fā)現(xiàn)ACE2蛋白過表達(dá)明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞在無外源性AngⅡ刺激下，ACE2也具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖效應(yīng)，這一結(jié)果目前國內(nèi)外少有相關(guān)報(bào)道。Ferrario等［10］研究表明ACE2發(fā)揮生物學(xué)作用主要是通過水解AngⅡ生成Ang(1-7)，Ang(1-7)通過MAS受體發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、降血壓、抗炎和抗氧化應(yīng)激等作用。具體機(jī)制目前主要認(rèn)為一方面可能是Ang(1-7)促進(jìn)緩激肽的增加或者是直接通過AT2R受體而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖等生物學(xué)作用，另一方面，如Deddish等［11］研究發(fā)現(xiàn)Ang(1-7)可以直接通過抑制ACE而發(fā)揮對抗AngⅡ介導(dǎo)的生物學(xué)作用。然而，我們研究發(fā)現(xiàn)ACE2過表達(dá)具有下調(diào)AT1R的作用，這與Zhang等［12］研究結(jié)果是一致的，這一發(fā)現(xiàn)提示ACE2抑制平滑肌增殖有可能是通過下調(diào)AT1R而實(shí)現(xiàn)的。

其次，Santos等［13］研究表明 AngⅡ可以通過AT1R及其下游多種信號分子如 Rac 1、JNK、p38MAPK等介導(dǎo)細(xì)胞增殖、血管收縮、增加氧化應(yīng)激等病理生理作用。本研究發(fā)現(xiàn)ACE2過表達(dá)后對ERK1/2的磷酸化有明顯抑制作用。已有的研究表明ACE2作用主要是通過降解AngⅡ生成Ang(1-7)而發(fā)揮生物學(xué)作用，如Su1等［14］研究發(fā)現(xiàn)，Ang(1-7)能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的近端小管細(xì)胞的MAPK磷酸化水平，且這種抑制作用能被Ang(1-7)的特異性受D-Ala7-Ang(1-7)所阻斷，提示Ang(1-7)可能是通過MAS受體抑制了ERK1/2的磷酸化。然而，我們發(fā)現(xiàn)ACE2過表達(dá)后明顯抑制平滑肌細(xì)胞AT1R蛋白表達(dá)以及其下游信號通路ERK1/2的磷酸化，這與Zhong等［15］研究結(jié)果一致，但其具體分子機(jī)制有待于我們更進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn) ACE2可以通過對AT1RERK1/2通路的影響而抑制平滑肌細(xì)胞的增殖從而發(fā)揮血管保護(hù)的作用，血管平滑肌細(xì)胞的增殖與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和PCI術(shù)后血管再狹窄等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，對于心血管疾病的臨床治療具有重要意義。對于ACE2在心血管疾病中所發(fā)揮具體作用的分子機(jī)制的研究，為其今后可能在心血管疾病治療中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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