微波提取下用HPLC測定油炸食品中的丙烯酰胺

田大年，汪嶺，丁潤梅

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)高等衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

長期以來，食品安全一直是人們最為關(guān)注的問題，自2002年4月瑞典國家食品管理局（NFA）公布一些高溫油炸和焙烤的淀粉類食品中含有丙烯酰胺（acrylamide，AA）以來，食品中AA的污染受到國際社會和各國政府的高度關(guān)注[1]。2005年2～3月，WHO和FAO對食品中的丙烯酰胺進(jìn)行系統(tǒng)的危險性評估，認(rèn)為食物是人類丙烯酰胺的主要來源，并呼吁世界各國采取措施以減少AA帶來的危害[2]。同年9月，我國衛(wèi)生部公布《食品中丙烯酰胺的危險性評估》報告，提醒人們改變以食用油炸和高脂肪食品為主的飲食習(xí)慣[3]。我國傳統(tǒng)的早餐食物如油餅、油條等，由于食用人群廣、食用頻率高、食用量大等原因，是人群中丙烯酰胺攝入的主要來源之一，而且油餅、馓子是我區(qū)回族人口餐桌必不可少的食品，因此油炸食品中AA的測定更具有深遠(yuǎn)的意義。

丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）為小分子白色結(jié)晶狀固體，溶于水、甲醇等溶劑，在室溫和稀酸性條件下穩(wěn)定，AA在食品中也較穩(wěn)定，遇堿水解成丙烯酸。丙烯酰胺除了具有一般毒性外，還具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性、致癌性以及生殖毒性[4]。因此，快速、準(zhǔn)確的檢測出食品中的丙烯酰胺更凸顯其重要。目前，對丙烯酰胺的檢測方法主要有GC-MS法、LC-MS法、LCMS-MS法等[5-7]，但因其均采用質(zhì)譜檢測器，雖定性準(zhǔn)確，但樣品前處理步驟多且相對復(fù)雜，檢測時間長，操作步驟繁瑣；另外所用檢測儀器價格昂貴，分析成本高。因此，不適于普通實(shí)驗(yàn)室的普及應(yīng)用。鑒于以上原因，本論文采用高效液相色譜儀，用微波提取，外標(biāo)法對銀川市油炸淀粉類食品中的丙烯酰胺進(jìn)行測定，顯示了良好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑

正己烷：上海國藥集團(tuán)；甲醇，色譜純：上海國藥集團(tuán)；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品：分析純；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)。

1.1.2 儀器型號

儀器D-2000 Elite高效液相色譜儀：日本日立公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；循環(huán)水式真空泵：河南鄭州科工貿(mào)有限責(zé)任公司；家用微波爐：格蘭仕；分析天平：梅特勒公司；500 mL分液漏斗；10 mL具塞比色管；100 mL量筒；100 mL容量瓶；50 mL容量瓶；50 mL具塞錐形瓶；普通漏斗；移液管；燒杯。

1.2 樣品采集

1.2.1 采集

樣品選取油條、馓子、油餅3種。其中，油條分別來自寧夏某高校食堂、泰和豆?jié){、沙湖賓館；馓子分別來自北京華聯(lián)、寧夏某購物中心、老大樓；油餅分別來自北京華聯(lián)、迎賓樓、新百連超勝利南街店。每種3份，共9份。

1.2.2 樣品均質(zhì)

將油條的3份樣品盡可能剪成小顆粒，并充分研磨且混勻，采用四分法稱取10 g樣品各3份待測。馓子、油餅均質(zhì)方法相同。每種油炸食品的待測樣品各3份，均為 10 g。

1.3 樣品前處理

稱取10.0 g均質(zhì)后的油炸食品，加入約30 mL甲醇，充分浸潤樣品，靜置，將樣品放入微波爐，調(diào)節(jié)合適的功率，使之保持微沸狀態(tài)，提取10 min，過濾，取濾液于燒杯；剩余殘渣加入10 mL甲醇，繼續(xù)提取10 min，過濾，取濾液，合并前后兩次濾液于分液漏斗中，向分液漏斗中加入30 mL正己烷，充分振蕩靜置分層后，去除上層油脂層，取下層清液于分液漏斗重復(fù)萃取三次后下層清液過濾于50 mL容量瓶，用甲醇定容，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾定容后的樣品液，將待測樣品容量最終定容為5 mL。各樣品均采用上述處理方法，油條、油餅、馓子三種油炸食品均得到三份樣品待測溶液。

1.4 高效液相色譜分析

1.4.1 色譜條件

Agilient RP—C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇：水溶液（5∶95，體積比）；流速為 0.8 mL/min；進(jìn)樣量為 5 μL；響應(yīng)時間：0.5 s；DAD 檢測器（監(jiān)測波長為210 nm）；柱溫為40℃。

1.4.2 定性分析

用丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品制得標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液測定丙烯酰胺的保留時間，樣品的定性分析采用與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相對照的方法進(jìn)行。

1.4.3 定量分析

樣品處理后進(jìn)行色譜分析，所得的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相比較，通過計算得出樣品中丙烯酰胺的實(shí)際濃度。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）0.100004 g，用甲醇∶水（5∶95）溶液溶解，定容于 100 mL 容量瓶，此時丙烯酰胺原液為1000μg/mL。準(zhǔn)確配制濃度梯度為1、2、5、8μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列。

對上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在1.4.1的色譜條件下進(jìn)樣，RP-HPLC測定，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

檢測波長的選擇見圖1。

圖1由DAD檢測器3D圖所得平面圖，如圖示，丙烯酰胺在210 nm～250 nm范圍內(nèi)有紫外吸收，在接近210 nm處有最大吸收，因此確定最佳檢測波長為210 nm。

2.1.2 流動相的選擇

分別采用甲醇，甲醇∶水（50∶50）、水、乙腈，乙腈∶水（50∶50）等流動相洗脫，發(fā)現(xiàn)流動相為甲醇∶水（5∶95）條件下，干擾少丙烯酰胺能夠達(dá)到較好的分離。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品丙烯酰胺紫外吸收光譜Fig.1 Standard ultraviolet absorption spectrum of acrylamide

2.1.3 流量和進(jìn)樣量的選擇

選擇了 0.5 mL/min～2.0 mL/min 流量，2 μL～15μL進(jìn)樣量以及C=1.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣。發(fā)現(xiàn)在流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，峰形以及出現(xiàn)時間及分離度比較良好。

2.2 樣品前處理方法選擇

2.2.1 提取溶劑及萃取劑的選擇

丙烯酰胺為極性化合物，提取一般采用水貨強(qiáng)極性物提取，采用甲醇提取得到了較好的效果，當(dāng)用水提取時雖然其在水中的溶解度大，但是也將一些其他大極性的物質(zhì)一起得到提取，影響到了丙烯酰胺的測定。有文獻(xiàn)報道，用石油醚可將油脂萃取掉，試驗(yàn)結(jié)果不佳，后改為正己烷，效果較石油醚好，能去掉油脂。

2.2.2 樣品液的濃縮

樣品處理液中丙烯酰胺含量較低，雖能分離，但是容易受到噪音干擾無法明顯的分離，因此對其進(jìn)行了濃縮，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾出部分甲醇，最后將其用甲醇定容至5 mL，待測。

2.3 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果

2.3.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度

1、2、5、8μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品在 1.4.1 的色譜條件下分離峰型較好，且保留時間均為5.61 min，見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（以5μg/mL的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)液為例）Fig.2 Standard chromatogram（5μg/mL standard of acrylamide）

2.3.2 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)系列在1.4.1的色譜條件下進(jìn)樣，RP-HPLC測定，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在1μg/mL～8μg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989，所得回歸方程為Y=6.844 E10-5X-5.787E10-1。

2.4 樣品測定結(jié)果

2.4.1 樣品色譜圖

樣品色譜圖如圖3、4、5所示。

圖3 油條樣品色譜圖（以樣品油條1為例）Fig.3 Chromatogram of Fried bread stick sample（Fried bread stick sample 1）

圖4 油餅樣品色譜圖（以樣品油餅2為例）Fig.4 Chromatogram of oil cake sample（oil cake sample 2）

圖5 馓子樣品色譜圖（以樣品馓子1為例）Fig.5 Chromatogram of San zi sample（San zi sample 1）

2.4.2 油炸淀粉類食物中丙烯酰胺測定結(jié)果

銀川市市售油炸淀粉類食物（油條、油餅、馓子）中均檢測出丙烯酰胺的存在，其含量范圍在1.862μg/g～19.664μg/g，結(jié)果見表 1。

2.5 HPLC的精密度與加標(biāo)回收率

2.5.1 精密度的測定

標(biāo)準(zhǔn)系列濃度1、5μg/mL同樣色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，其RSD分別為3.36%、2.33%。

表1 銀川市油炸淀粉類食物中丙烯酰胺的分析結(jié)果Table 1 The result of AA found in yinchuan fried starchy foodsμg/g

2.5.2 加標(biāo)回收率

稱取陰性樣品（面粉）10 g，分別添加丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)液各1 mL，靜置5 min.按1.3和1.5進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個添加水平做平行3次，分離結(jié)果見圖6。

圖6 陰性加標(biāo)回收分離色譜圖Fig.6 Chromatogram of negative recovery

計算回收率和精密度，結(jié)果如表2所示。

表2 不同添加水平的丙烯酰胺回收率（n=3）Table 2 Effect of different addition of AA recovery（n=3）

3 分析結(jié)果討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示3種油炸食品中丙烯酰胺的含量分別為：油餅（19.103μg/g）＞ 馓子（12.615μg/g）＞ 油條（1.887μg/g）。分析其主要原因在于制作工藝的不同：由于油餅單個體積較大，含淀粉較多，炸的時間較長，但為其色澤金黃，該過程通常選用七八成火（不超過200℃），因此，油溫可以較穩(wěn)定的保持在一定高度，而丙烯酰胺產(chǎn)生的最適宜溫度在140℃～180℃，因此油餅中丙烯酰胺有較高產(chǎn)出[8]；馓子由于其為了達(dá)到酥脆的口感，在火候的選擇上與油餅相似，但由于其制作時加入硫酸鋁鉀和碳酸鈉，油炸時，在高溫作用下，礬堿中和反應(yīng)更快，油的高溫會蒸發(fā)掉面團(tuán)中的水分，并且，在調(diào)制面團(tuán)時摻入鹽，由于鹽的滲透作用，把面團(tuán)中蛋白質(zhì)的一部分水滲出來，所以馓子的水分含量低于油餅，因?yàn)?，水分含量越低，丙烯酰胺含量越高，可能由于馓子制作中加入別的非淀粉類物質(zhì)，造成淀粉物質(zhì)所占比重較少，還有水分含量對丙烯酰胺含量的影響被長時間的油炸所掩蓋；油條在制作中也發(fā)生礬堿反應(yīng)遇高溫膨松，油溫通常高于油餅油條，且油炸時間小于油餅油條，口感外酥里嫩，水分含量高于馓子，所以其丙烯酰胺的含量較三者相比最低[9]。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)在微波作用下能夠?qū)⒂驼ㄊ称分械谋０诽崛〕鰜?，HPLC檢測發(fā)現(xiàn)在寧夏回族人口中所食用的油炸食品中油餅中的丙烯酰胺含量較高，馓子中的含量次之，油條含量較少。而油餅及馓子作為回族人口餐桌必不可少的食品，如何減少其中的丙烯酰胺的含量成為食品加工的重要課題。

本次實(shí)驗(yàn)分析方法的RSD小于5.32%，儀器精密度測定RSD小于3.36%，陰性加標(biāo)回收率為78.6%～110.2%，說明實(shí)驗(yàn)可信度較好，結(jié)果較準(zhǔn)確，且方法簡便，快速。

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