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    秦皮乙素對小鼠皮下Hepa1-6肝癌移植瘤凋亡基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響Δ

    2012-12-03 03:34:52王麗紅偉忠民遼寧醫(yī)學(xué)院遼寧錦州121001遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院遼寧錦州121000
    中國藥房 2012年15期
    關(guān)鍵詞:秦皮乙素肝癌

    王麗紅,偉忠民(1.遼寧醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州121000)

    秦皮為常用中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,以后歷代主要本草均有記載。2010年版《中國藥典》收載了4種秦皮,視為正品,來源為木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance、白蠟樹F.chinensis Roxb.、尖葉白蠟樹F.szaboana Lingelsh.或宿柱白蠟樹F.stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮[1]。秦皮乙素(Esculetin)為秦皮的有效成分之一?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,秦皮有抗病原微生物、抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等作用[2]。前期體外細(xì)胞試驗證明,秦皮乙素對人肝癌細(xì)胞有殺傷作用,筆者進(jìn)一步研究秦皮乙素對小鼠肝癌皮下瘤生長的抑制和對相關(guān)凋亡基因的影響,探討其抗癌的相關(guān)機制。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    Napro-6100型CO2培養(yǎng)箱(美國杜邦公司);YG-875 B型無菌超凈工作臺(上海醫(yī)療器械廠);KA-1000 C型飛鴿離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);CX21型雙目生物顯微鏡(日本Olympus公司);WD-9413 B型凝膠成像分析儀(上海圣科儀器設(shè)備有限公司);DYY-7 C型電泳儀(北京六一儀器廠);Life Express PCR儀(杭州四格生物有限公司);NANO 2000型紫外分光光度計(美國Thermo公司)。

    1.2 試藥

    秦皮乙素(筆者自制,含量:94.47%,平均收率:96.35%);注射用環(huán)磷酰胺(CTX,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號:09031521,規(guī)格:0.2 g/支);DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司);兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司);Bcl-2、Bax引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 動物與細(xì)胞株

    C57 BL/6 J小鼠60只,6~8周齡,♂,體重20~22 g,由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(遼)2008-0005)。Hepa1-6細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫。

    2 方法

    2.1 復(fù)制模型與分組、給藥

    Hepa1-6細(xì)胞、DMEM(高糖)90%、胎牛血清10%置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞處于對數(shù)生長期時,0.2%臺昐藍(lán)染色,活細(xì)胞密度>95%。收集細(xì)胞于PBS中,制成單細(xì)胞混懸液,參照文獻(xiàn)[3]每只小鼠右腋sc 0.2 mL(約1×107個)。模型復(fù)制成功后,小鼠隨機分成5組,即模型(生理鹽水0.2 mL)、CXT(100 mg·kg-1)和秦皮乙素高、中、低劑量(700、400、200 mg·kg-1)組。復(fù)制模型3 d后ip給藥,每天1次,連續(xù)15 d。

    2.2 抑瘤率的計算

    于末次給藥24 h后,麻醉小鼠取出瘤組織,稱重。抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。

    2.3 秦皮乙素對Bax mRNA、Bcl-2mRNA表達(dá)的影響

    按照試劑盒說明提取總RNA,提取的RNA經(jīng)紫外分光光度儀分別測量260、280 nm波長處吸光度,由260 nm波長處吸光度計算出RNA濃度。按照RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴增。凝膠電泳觀察可見18、28S RNA帶。Bax上游引物:5′-CCAGGATGCGTCCACCAAGAA-3′,下游引物:5′-AGCA AAGTA-AAGAGGGCAACCAC-3′;Bcl-2上游引物:5′-CTCTGGTTGGGATTCCTACGG-3′;下游引物:5′-CGGCATGATCTTCTGTCAAGTTTA-3′;GAPDH 上游引物:5′-TGTTCCTACCC-CCAATGTGTCCGTC-3′,下游引物:5′-CTGGTCCTCAGTGTAGCC-CAAGATG-3′。反轉(zhuǎn)錄條件:95℃ 加熱5 min終止反應(yīng),置冰上進(jìn)行后續(xù)實驗或冷凍貯藏。然后進(jìn)行30個周期的PCR擴增反應(yīng),PCR擴增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下:95℃、5min預(yù)變性1個循環(huán),每個周期為95℃變性20s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s。取PCR產(chǎn)物10μL與2μL的上樣緩沖液混合,用1×TAE緩沖液配制2%瓊脂糖進(jìn)行水平平板電泳,電壓5 V·cm-1,電泳40 min,在紫外光燈下觀察,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。分別以Bax、Bcl-2與GAPDH比值作為其相應(yīng)的表達(dá)參數(shù),對Bax mRNA、Bcl-2 mRNA產(chǎn)物相對定量。

    2.4 秦皮乙素對Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

    將存于-80℃冰箱中的組織解凍,加入裂解液制成勻漿,高速離心后取上清液,測出蛋白含量后加入上樣緩沖液混勻,水浴加熱5 min后-20℃冰箱中保存。灌制10%SDS-PAGE分離膠與濃縮膠于電泳液中進(jìn)行上樣,電泳后采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上,TBS沖洗,封閉液封閉0.5h加入一抗,4℃過夜,洗膜。加入二抗,室溫下在搖床上雜交1 h,洗膜3次。NBT/BCIP顯色,應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描照相。以四星圖像處理系統(tǒng)測定各組蛋白表達(dá)量與內(nèi)參GAPDH表達(dá)量的比值作為各自表達(dá)水平的參數(shù)。

    2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 秦皮乙素對小鼠皮下肝癌瘤的抑制作用

    秦皮乙素高、中、低劑量組抑瘤率分別為55.42%、40.37%、20.33%,各組瘤重指數(shù)(瘤重指數(shù)=各組瘤重/小鼠體重)均顯著低于模型組(P<0.01)。秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用見表1。

    表1 秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用(±s,n=8)Tab 1 Inhibition effects of aesculetin on tumor growth of model mice(±s,n=8)

    表1 秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用(±s,n=8)Tab 1 Inhibition effects of aesculetin on tumor growth of model mice(±s,n=8)

    與模型組比較:*P<0.01vs.model group:*P<0.01

    組別模型組秦皮乙素低劑量組秦皮乙素中劑量組秦皮乙素高劑量組CTX組n 88888劑量/mg·kg-1-200400700100瘤重指數(shù)1.358±0.13021.039±0.0029*0.772±0.0065*0.589±0.0013*0.487±0.0047*抑瘤率/%-20.33*40.37*55.42*65.03*

    3.2 秦皮乙素對Bax mRNA、Bcl-2mRNA表達(dá)的影響

    按照實驗方法中的步驟進(jìn)行提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計測量260和280 nm吸光度的比值均為1.8~2.0。與模型組比較,Bax mRNA表達(dá)隨著秦皮乙素劑量的增高熒光強度逐漸增強,顯著高于模型組(P<0.01),Bcl-2 mRNA的表達(dá)隨著秦皮乙素劑量的增高熒光強度逐漸減弱,顯著低于模型組(P<0.01)。結(jié)果表明,秦皮乙素對小鼠皮下肝癌瘤組織Bax基因表達(dá)起到促進(jìn)作用,對Bcl-2基因表達(dá)起到抑制作用。mRNA表達(dá)見圖1。

    圖1 mRNA表達(dá)Fig 1 The mRNAexpression

    3.3 秦皮乙素對Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

    分別檢測不同組中Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)量(條帶灰度值),其與內(nèi)參β-actin表達(dá)量的比值為相對表達(dá)量。與模型組比較,秦皮乙素高、中、低劑量組Bax蛋白表達(dá)受到明顯激活,而Bcl-2蛋白表達(dá)受到明顯抑制,與模型組比較均有顯著性差異(P<0.01)。蛋白表達(dá)見圖2。

    圖2 蛋白表達(dá)Fig 2 The protein expression

    4 討論

    近年來,從天然動、植物中尋找毒性低、療效高的抗腫瘤藥物已成為當(dāng)前國內(nèi)、外研究的熱點和共識[4]。目前,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的一個重要途徑[5]。中藥的抗腫瘤機制之一就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,許多中藥的有效成分或其提取物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[6]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白,分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白,Bax是廣泛的促凋亡蛋白。大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生異常時,Bcl-2表達(dá)升高,Bax表達(dá)下降。過高的抑凋亡蛋白表達(dá)打破了正常細(xì)胞凋亡機制,使癌癥細(xì)胞獲得了生長的優(yōu)勢,對凋亡信號表達(dá)不敏感[7]。在促凋亡因素的刺激下,抑制Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bax的表達(dá)。通過上調(diào)Bax與Bcl-2比值,誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。體外細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn),秦皮乙素能抑制人肝癌細(xì)胞增殖,阻滯于S期,誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[8]。體內(nèi)抑瘤實驗結(jié)果是評價抗腫瘤藥物有效性的重要指標(biāo),其中移植性動物腫瘤模型具有接種成功率高、實驗周期短、重復(fù)性好等優(yōu)點[9]。所以,本研究選用近交系C57 BL/6 J小鼠sc鼠源Hepa-6細(xì)胞復(fù)制模型。結(jié)果表明,秦皮乙素對小鼠肝癌皮下瘤生長起到不同程度的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量依賴性,各劑量組瘤重均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CTX組抑瘤率高于秦皮乙素各劑量組,但與秦皮乙素各組相比小鼠嚴(yán)重消瘦,毛色無光澤,食欲、活動力均下降,出現(xiàn)了化療藥物的不良反應(yīng)。秦皮乙素各組小鼠狀態(tài)良好,其中高劑量組抑瘤率與CTX組相近。RT-PCR、Western blot檢測結(jié)果表明,秦皮乙素促進(jìn)了Bax基因與蛋白的表達(dá),降低了Bcl-2基因與蛋白的表達(dá)。綜上所述,秦皮乙素可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,其誘導(dǎo)小鼠肝癌瘤細(xì)胞凋亡的機制之一可能是調(diào)節(jié)凋亡基因Bax/Bcl-2的表達(dá)水平,但具體是哪一種凋亡途徑啟動Bax、Bcl-2基因的表達(dá),還有待進(jìn)一步研究。

    [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:245.

    [2]方蓮花,呂 楊,杜冠華.秦皮的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2008,33(23):2773.

    [3]周忠信,呂明德,殷曉熠,等.C57 BL/6 j小鼠接種Hepa1-6細(xì)胞誘導(dǎo)皮下肝癌模型的建立[J].廣東醫(yī)學(xué),2007,28(2):178.

    [4]劉明華,肖 順,任美萍,等.克癌新及其拆方對荷瘤小鼠腫瘤生長和細(xì)胞因子的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(12):3150.

    [5]吳 劍,滕國英.中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報,2007,13(8):114.

    [6]陳香濤.中藥抗腫瘤機制研究進(jìn)展[J].中國實用醫(yī)藥,2010,5(14):238.

    [7]李曉琦,原繼榮.Bcl-2/Bax在宮頸癌診斷中的研究進(jìn)展[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2010,18(8):468.

    [8]王 晶,王洪新,李紅玉,等.秦皮乙素的制備及對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721體外增殖的影響[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2009,26(6):439.

    [9]戰(zhàn)曉農(nóng),余衛(wèi)華,劉 戀,等.雙氫青蒿素干預(yù)結(jié)直腸癌模型動物腫瘤生長的實驗研究[J].廣東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,26(5):465.

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