萎胃消對萎縮性胃炎癌前病變患者PTEN和ERK2蛋白表達的影響＊

鐘 毅，趙自明，饒梅冰，戈 焰，范 明

(1.廣東省第二中醫(yī)院消化科，廣州 510095;2.廣東省中醫(yī)研究所，廣州 510095)

慢性萎縮性胃炎(Chronic Atrophic Gastdtis，CAG)是以胃黏膜固有腺體破壞﹑萎縮為特征的一種常見消化系統(tǒng)疾病，1978年世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列為胃癌的癌前狀態(tài)，而在此基礎(chǔ)上伴有不完全腸腺化生和(或)中、重度不典型增生則被視為癌前病變。目前對本病的治療西醫(yī)西藥以對癥治療為主，療效不甚確切，而中醫(yī)藥治療 CAG療效肯定，不僅可以逆轉(zhuǎn)腺體的萎縮，甚至可使不完全腸腺化生及不典型增生逆轉(zhuǎn)，因此一直受到醫(yī)藥學界的廣泛關(guān)注［1］。本研究于2008年1月 ～2010年6月采用萎胃消治療萎縮性胃炎癌前病變患者30例，探討其對患者胃黏膜細胞增殖信號傳導調(diào)控蛋白PTEN和ERK2表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本資料60例患者均為我院門診和住院病人，全部符合2002年《中藥新藥治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究指導原則》［2］中慢性萎縮性胃炎伴胃黏膜上皮異型增生或/和不完全型結(jié)腸上皮化生的納入標準。采用整體隨機化方法分為治療組和對照組。治療組30例，其中男21例，女9例;平均年齡43歲±7歲;平均病程12±8年;伴不完全腸上皮化生23例，伴胃黏膜異型增生19例;對照組30例，其中男19例，女11例;平均年齡41歲±6歲;平均病程14±7年;伴不完全腸上皮化生21例，伴胃黏膜異型增生18例。2組患者治療前性別、年齡、病程、臨床癥狀、病理診斷比較均無顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法

治療組:口服萎胃消顆粒:太子參 15g，黃芪10g，白術(shù) 10g，薏苡仁 20g，石斛 10g，生地 10g，龜甲10g，天花粉 10g，枳實 12g，莪術(shù) 10g，山楂 20g，白花蛇舌草15g，半枝蓮 15g，雞內(nèi)金10g，甘草 6g等，制成顆粒劑，1袋/次，1次/d;對照組:口服維酶素由北海陽光藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批準文號國藥準字H45021183，規(guī)格 100 × 0.2g/瓶)，1.0g/次，3 次/d，療程3個月。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 研究設(shè)備 Olympus CV-240電子胃腸鏡，德國Zeiss公司;Microm-340E型石蠟切片機，英國Shandon公司;Hypercenter-XP組織脫水機，英國Shandon公司;Histocentre-2型組織包埋機、HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)。

1.3.2 臨床癥狀和體征 用藥前后紀錄患者胃脘痛、脹悶、噯氣、納差、乏力、嘈雜泛酸、口苦口干、大便不調(diào)等臨床表現(xiàn)。

1.3.3 胃鏡和常規(guī)病理組織學變化 治療前1d、停藥后1周內(nèi)各做電子胃鏡、病理檢查1次。治療前2周內(nèi)停服相關(guān)抗炎藥物。電子胃鏡檢測:治療前后均根據(jù)電子胃鏡的黏膜顏色改變、萎縮黏膜的范圍、黏膜厚薄及黏膜血管透見程度、黏膜光澤變化等進行判斷。病理學指標檢測:活檢部位以胃竇2塊取自距幽門2cm～3cm處的大彎和小彎;胃體2塊取自距賁門8cm處的大彎和小彎(約距胃角近側(cè)4cm);胃角1塊。對可能或肯定存在的病灶要另取標本。標本要足夠大，達到黏膜肌層，不同部位的標本需分開裝瓶。標本均常規(guī)用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，H-E染色并切片，光鏡下進行胃黏膜病理組織學檢查，可依據(jù)固有腺體萎縮程度、黏膜肌層增厚、腸上皮化生、固有膜炎癥、淋巴濾泡形成來檢測。

1.3.4 胃黏膜細胞增殖信號傳導調(diào)控蛋白PTEN和ERK2表達的免疫組化檢測 采用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶方法(S-P法)檢測。鼠抗人單克隆抗體 PTEN、ERK2及 S-P廣譜超敏試劑盒(即用型)、DAB酶底物顯色劑等均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。具體步驟:胃黏膜標本石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS漂洗，浸泡于3%H2O2(20min)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS(0.05mmol·L－1，pH7.4)洗3次，每次5min。組織切片置于 10mmol·L－1枸櫞酸鈉(pH6.0)溶液，微波爐中沸騰 10min冷卻到室溫，用 PBS(0.05 mmol·L－1，pH7.4)洗 3次，每次 5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。加入試劑，陰性對照用 0.05mmol·L－1PBS代替一抗，4℃ 過夜。用 PBS(0.05mmol·L－1，PH7.4)洗3次，每次5min。滴加生物素化二抗，20℃ ～37℃20min，用 PBS(0.05mmol·L－1，pH 7.4)洗 3次，每次5min。滴加試劑 SABC，20℃ ～37℃20min，用 PBS(0.05mmol·L－1，pH7.4)洗 3 次，每次 5min。DAB顯色，蒸餾水洗終止反應。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 療效評定標準

2.1.1 中醫(yī)證候療效判定標準 參照《中藥新藥治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究指導原則》［2］擬定，并將癥狀嚴重程度按無、輕、中、重分別記為0、1、2、3分。臨床治愈:臨床癥狀、體征消失或基本消失，證候積分減少≥95%;顯效:癥狀、體征明顯改善，證候積分減少≥70%;有效:主要癥狀、體征明顯減輕，證候積分減少≥30%;無效:癥狀、體征無明顯改善甚或加重，證候積分減少不足30%。

2.1.2 疾病療效判定標準 參照《中藥新藥治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究指導原則》［2］制定。臨床治愈:胃鏡復查黏膜炎癥明顯好轉(zhuǎn)達輕度，病理檢查證實腺體萎縮、腸上皮化生和異型增生恢復正?；蛳?顯效:胃鏡復查黏膜炎癥好轉(zhuǎn)，病理檢查證實腺體萎縮、腸上皮化生和異型增生恢復正?；驕p輕2個級度;有效:胃鏡復查黏膜病變范圍縮小1/2以上，病理檢查證實炎癥減輕1個級度以上，腺體萎縮、腸上皮化生和異型增生減輕;無效:胃鏡復查、病理檢查達不到上述有效標準或惡化。

2.1.3 免疫組化結(jié)果判定 細胞漿內(nèi)見棕褐色顆粒染色為陽性。每個切片選5個高倍視野，按陽性細胞數(shù)占同類細胞總數(shù)的百分比來計算。≤5%為陰性(－)，6% ～25%為表達陽性(+)，26%～50%為表達顯著陽性(++)，＞50%為表達強陽性(+++)。并以各細胞表達強度積分:(－)為1分、(+)為2分，(++)為3分，(+++)為4分。觀察染色情況，并進行各組染色強度積分統(tǒng)計。

2.2 2組患者中醫(yī)證候療效比較

表1顯示，中醫(yī)證候療效總有效率治療組為90%，對照組為56.67%，2組間比較差異有顯著性(P ＜0.01)。

表1 2組治療后中醫(yī)證候療效比較

2.3 2組患者治療前后胃鏡、病理變化情況比較

表2 2組治療后胃鏡、病理變化療效比較

2組患者均在治療前后進行內(nèi)鏡檢查，經(jīng)治療后治療組顯效5例，有效16例，無效9例，總有效率為70%;對照組有效10例，無效20例，總有效率為33.33%，治療組總有效率顯著高于對照組(P＜0.01)。

2.4 2組患者治療前后PTEN和ERK2積分變化的比較

表3 2組治療前后PTEN和ERK2積分變化比較(±s)

表3 2組治療前后PTEN和ERK2積分變化比較(±s)

注:與治療前比較:△P ＜0.05，△△P ＜0.01

調(diào)控 治療組(n=30)對照組(n=30)治療前 治療后 治療前 治療后PTEN 5.17 ± 0.43 5.83 ±0.12△蛋白4.79 ± 1.10 4.65 ±0.78 5.37 ± 1.08 5.37 ±2.02 ERK2 4.81 ±0.98 3.83 ±1.11△△

表3顯示，黏膜PTEN積分表達情況比較，治療組治療后與治療前比較，P ＜0.05(t=7.086)，可見中藥治療組黏膜PTEN表達經(jīng)治療有顯著提高，而西藥對照組PTEN表達水平變化不明顯。黏膜ERK2積分表達情況比較，治療組治療后與治療前比較，P ＜0.01(t=3.33)，可見中藥治療組黏膜ERK2表達經(jīng)治療有顯著降低，而西藥對照組ERK2表達水平變化不明顯。

3 討論

研究證明，胃黏膜上皮細胞癌變并非是由正常細胞一躍而成為癌細胞，而是一個漸進的過程，在這一過程中的不同階段，致病因素作用于不同的基因并引起相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和表達水平改變，最終導致胃癌的發(fā)生。目前普遍認為，幽門螺桿菌→慢性胃炎→胃黏膜萎縮→腸化生→異型增生→胃癌，是胃癌發(fā)生的基本模式。在發(fā)展為惡性腫瘤之前，常經(jīng)歷多年持續(xù)的癌前變化，若能及早識別和治療這些病變，不失為防治胃癌的有效途徑［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜病變尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞增殖、凋亡關(guān)系密切，細胞增殖、凋亡的相互消長決定了許多胃黏膜病變的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸［4、5］。細胞信號傳導通路控制著細胞的所有活動，許多癌基因和抑癌基因位于信號傳導通路的不同部位，參與重要的細胞活動過程。蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)是近年新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，可負調(diào)控多種細胞信號傳導通路，參與正常細胞的生長、發(fā)育并抑制腫瘤的發(fā)生［6］。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERKs)是絲裂原活化蛋白激酶家族的一個亞族，包括 ERK1和 ERK2，ERK 參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。高琦等［8］研究顯示，PTEN的表達與ERK2的表達呈負相關(guān)，隨著PTEN表達的減弱，ERK2表達增強，反之亦然。提示在胃癌發(fā)生發(fā)展中，可能是由于PTEN蛋白的低表達或失表達，不能有效抑制ERK信號通路的異常激活，使細胞異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化，并促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。

慢性萎縮性胃炎屬中醫(yī)胃痛或胃痞范疇。對CAG癌前病變的病機多數(shù)醫(yī)家認為屬本虛標實，本虛以脾胃氣陰兩虛為主，標實則有氣滯、血瘀、濕阻、熱毒蘊胃等且多呈兼之勢，病初為實多虛少，以實為主，后期以虛為主，故在治療中必須注意整體與局部兼治，通過調(diào)整整體功能的活動來促進胃黏膜局部病變的好轉(zhuǎn)。根據(jù)中醫(yī)辨證論治的原則，通過臨床觀察，學者認為胃癌前病變患者均表現(xiàn)不同程度的脾胃虛弱，故健脾益氣為治療的主要原則。許多醫(yī)家也同樣認為對胃癌前病變治療亦在健脾益氣的基礎(chǔ)上，加清熱解毒、護膜抑癌之品，可收較好的效果。而活血化瘀治療胃癌前病變也是重要的方法和優(yōu)勢。研究表明，活血化瘀藥可改善胃黏膜微循環(huán)，并建立側(cè)枝循環(huán)，增加血流量，使局部缺血缺氧得到改善，促進局部炎癥的吸收及萎縮腺體復生，因而活血化瘀是治療胃癌前病變的關(guān)鍵。同樣中醫(yī)的“證”與組織學的變化亦證明，氣滯血瘀型、異型增生者為最多，腸化生亦常見于脾胃氣陰虛者，這為治療方藥的應用提供了客觀證據(jù)［1］。

萎胃消是根據(jù)作者20多年臨床治療萎縮性胃炎經(jīng)驗總結(jié)擬定的復方制劑，該方太子參、黃芪、白術(shù)、薏苡仁益氣健脾，石斛、生地、龜甲、天花粉養(yǎng)陰清熱，枳實、莪術(shù)、山楂理氣化瘀，白花蛇舌草、半枝蓮、雞內(nèi)金解毒散結(jié)，全方功補兼施、調(diào)和胃腸，共奏益氣養(yǎng)陰、理氣化瘀、解毒散結(jié)之功效。

本研究采用隨機、單盲、陽性藥平行對照臨床試驗方法，觀察萎胃消治療慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生和/或胃黏膜異型增生30例。結(jié)果顯示，治療組能顯著改善癥狀，逆轉(zhuǎn)部分腺體萎縮、腸上皮化生和異型增生，在癥狀療效、胃鏡和病理變化上都較對照組有明顯優(yōu)勢。同樣治療組治療前后患者胃黏膜細胞增殖信號傳導調(diào)控蛋白PTEN和ERK2表達差異有統(tǒng)計學意義。表明萎胃消具有良好的胃癌前病變逆轉(zhuǎn)治療效應，其作用機理可能是通過上調(diào)抑癌基因蛋白PTEN的表達和有效抑制ERK信號通路的異常激活，從而達到抑制胃黏膜組織的過度增殖，逆轉(zhuǎn)腸化及異型增生，防止細胞失控性生長等作用。

［1］王冠庭.胃黏膜癌前病變及其逆轉(zhuǎn)的研究［J］.現(xiàn)代消化及介入診療，2002，7(上消化道疾病研究進展專輯):79-82.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部.中藥新藥臨床研究指導原則［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2002:124-129.134-139.151-155.

［3］王長洪，林一帆，楊 卓.胃炎腸上皮化生與胃癌［J］.現(xiàn)代消化及介入診療，2002，7(上消化道疾病研究進展專輯):74.

［4］Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease［J］.Science，1995，267:1456-1460.

［5］Potten CS，Booth C.The role of radiation induced and spontaneous apoptosis in the homestasis of the gastrointestinal epithelium:a brief review［J］.Comp Biochem Physiol B Bioche m Mol Biol，1997，118:473-478.

［6］Wu H，Goel V，Haluska FG，et al.PTEN signaling pathways in melanoma［J］.Oncogene，2003，22(20):3113-3122.

［7］Feng DY，Zheng H，Tan Y，et al.Effect of phosphorylation of MAPK and Stat 3 and expression of c-fos and c-jun protein on hepatocarcinogenesis and their clinical significance［J］.World J Gastronerol，2001，7(1):33-36.

［8］高 琦，李繼昌.PTEN和 ERK2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的表達［J］.中國誤診學雜志，2005，5(5):813-815.