補中益氣法對甲減大鼠心肌α-MHC和β-MHCmRNA表達的影響＊

高天舒，尹慧絲

(1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內分泌科，沈陽 110032;2.遼寧大學醫(yī)院，沈陽 110031)

甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)是臨床常見的內分泌疾病，近年來有關甲減心肌損傷的報道不斷增加。甲減心臟損傷最早由Zondek于1918年報道，肌球蛋白由Kuhne于1859年首先報道，是心肌的主要收縮蛋白。心臟是受TH調節(jié)的重要靶器官之一，肌球蛋白作為影響心肌收縮的主要結構蛋白，其重鏈(MHC)基因(α-MHC、β-MHC的基因)是甲狀腺激素TH調節(jié)的重要靶基因。

中醫(yī)學認為，原發(fā)性甲狀腺功能減退癥應歸屬中醫(yī)學虛勞范疇。我們在臨床工作中也發(fā)現(xiàn)，甲減發(fā)病之初多存在脾氣虛，治療上運用補中益氣法治療甲減取得了較好的療效。補中益氣湯具有調補脾胃、升陽舉陷之功能，全方中黃芪益氣為君，紅參、白術、甘草補氣健脾和中為臣，輔以陳皮、當歸、升麻及柴胡使本方在臨床上取得了較好的療效。

我們前期研究還發(fā)現(xiàn)，補中益氣法可以明顯降低甲減大鼠血清CK、CK-MB水平，提高甲減鼠血清T3水平［1］，但對甲減心肌損傷的改善是否與調節(jié)肌球蛋白重鏈α和β基因表達有關未見報告。故本實驗重點研究補中益氣法對甲減大鼠心肌 α-MHC和β-MHCmRNA表達的影響，對進一步證實中藥對甲減致心肌損傷的修復作用及其作用機制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 4周齡清潔級Wistar大鼠120只，體質量90g～120g，雌雄各半，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號SCXK(京)2009-0004)。

1.1.2 動物飲食 普通飼料:由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。低碘飼料:根據(jù)衛(wèi)生部地方病調查、中國醫(yī)科大學流行病學結果以及承德市地方病研究所提供的資料，采用全國重度缺碘地區(qū)河北省承德市隆化縣大兩間房村的玉米、谷子、黃豆，按73∶20∶7的比例，加入適量的添加劑(每100g飼料添加 CaCO30.5g，Na2HPO40.15g，MnSO450mg，維生素 B66mg，維生素 B120.05mg，泛酸鈣5.5mg，葉酸 0.1mg，CoCl24.95μg，寶力維他 20mg，酵母粉1g)，由沈陽市于洪區(qū)前民實驗動物飼料加工廠制成低碘飼料，其碘含量為20 μg/kg。

1.1.3 試劑 大鼠血清 TT3、TT4放免試劑盒(北京賽博潤特科技發(fā)展中心提供)、血清TSH測定試劑盒(美國 Rapid Bio公司)、凍干人尿中碘成分分析標準物質(購自國家碘缺乏病參照實驗室)、cDNA合成試劑盒(寶生物工程大連有限公司)、熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)、Triozol Reagent(美國Invitrogen Life technologies公司)、4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)、2.5%戊二醛(國藥集團化學試劑有限公司)、20%烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司)、PBS緩沖液(國藥集團化學試劑有限公司)、高氯酸鈉(化學純，國藥集團化學試劑有限公司)、左甲狀腺素鈉片(德國默克公司)。

1.1.4 儀器 小型臺式離心機(美國SIGMA，1-13)、高速冷凍離心機 sigma 31k5C型(美國)、PCR擴增儀(德國 Biometra)、紫外分光光度計(英國 UV-visible Spectrometer，UV300)、ABI 7500 擴增儀、DK-8B型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)、BIO-DAD 680 酶標儀、FJ-2008 PS γ 記數(shù)儀、切片機(德國 Leica公司)、心電圖機(日本光電)、DS-671型電子秤(上海寺岡電子有限公司)、代謝籠(蘇州市實驗試劑玻璃儀器廠)、灌胃器(沈陽市實驗試劑玻璃儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備和處理因素 甲減動物造模方法按照Kolaja法［2］制作，選用4周齡清潔級Wistar大鼠(90g～120g)，雌雄各半，每天飼以低碘飼料，同時喂含1%高氯酸鈉的雙蒸水19d，續(xù)喂雙蒸水2d，造模成功后將實驗組隨機分成3組，即模型對照組、L-T4組、補中益氣湯組，每組30只。

處理因素:正常對照組飼以普通飼料，每只鼠每天灌服4ml雙蒸水;模型對照組低碘飲食，每日灌服4ml雙蒸水;L-T4組低碘飲食，每天灌服 2ml含2.6μg/kg左甲狀腺素鈉片的混懸液(根據(jù)體重約1～2周增加2.6μg/kg)，并灌服等體積雙蒸水;補中益氣湯組低碘飲食，每天灌服 2ml含生藥量13.96g/kg的補中益氣湯(補中益氣湯:升麻、柴胡、陳皮、當歸、白術、紅參、炙甘草、黃芪。按人的常規(guī)日處方劑量，按與人相同體表面積折算)，并灌服等體積的雙蒸水。動物處死時間和數(shù)量:分別在給處理因素后的0、8周處死動物，每組每次相應處死12只動物。

1.2.2 標本采集 處死前1d將大鼠放入代謝籠中，留 24h空腹尿，吸取 3ml～5ml，放入 5ml eppendoff管中，－20℃冰柜中保存，用于尿碘測定。處死前稱體重，20%烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，3000r/min離心 10min，血清存入 1.5ml eppendoff管中，－20℃ 冰柜中保存待測 TT3、TT4、TSH。處死后迅速摘取心臟，用預冷的生理鹽水沖凈心腔內殘余血，濾紙吸凈后稱質量，取左心室心肌組織 2塊，一塊放入 1.5ml eppendoff管中，滴入1mlTrizol試劑，－80℃保存，用于實時定量 PCR的檢測;一塊于4%的多聚甲醛中固定，用于光鏡標本的制作。摘取甲狀腺，剝離殘余結締組織，置于4%的多聚甲醛中固定，用于光鏡標本的制作。

1.2.3 甲狀腺功能測定 血清促甲狀腺激素(TSH)測定采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，美國 Rapid Bio試劑盒。血清總 T3(TT3)、總T4(TT4)采用放射免疫分析法(RIA法)。

1.2.4 甲狀腺形態(tài)學觀察 分離甲狀腺后，于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm厚切片，進行HE染色光鏡觀察。

1.2.5 尿碘測定 采用中華人民共和國衛(wèi)生部行業(yè)標準砷鈰分光光度法。

1.2.6 心電圖描記 各組隨機抽取6只大鼠，于處死前1d乙醚麻醉，針狀電極刺入大鼠上下肢內側皮下，用心電圖機記錄肢體導聯(lián)心電圖，走紙速度50mm/s，標定電壓 1mV=10mm。

1.2.7 心臟的臟器指數(shù) 稱取大鼠體質量和心臟質量，計算心臟的臟器指數(shù)(臟器指數(shù)是指某臟器質量與體質量的比值，常以每100 g體質量計算)。

1.2.8 心肌細胞形態(tài)學觀察 迅速摘取心臟，用預冷的生理鹽水沖凈心腔內殘余血，取左心室心肌組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm厚切片，進行HE染色，光鏡觀察。

1.2.9 心肌組織 α-MHC和 β-MHC mRNA的表達 心肌細胞總RNA的提取:于左心室取0.1g心肌組織，總RNA提取方法按照Triozol Reagent(美國Invitrogen Life technologies產(chǎn)品)試劑說明書進行。采用紫外可見光分光光度計(英國 UV-visible Spectrometer，UV300)測定 260nm、280nm OD 值，并計算RNA的純度及含量。樣品－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時定量RT-PCR:①逆轉錄:應用cDNA合成試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)合成cDNA。取2μL總 RNA作為 imoban，oligo-dT做引物，反應體系為 20μL，反應條件為 37℃15min，85℃ 5s;②實時定量 RT-PCR:α-MHC、β-MHC 和內參照 β-actin基因擴增的引物序列均由北京華大基因公司設計并合成;③PCR反應體系為:SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL，PCR Forward Primer(10μM)0.4μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.4μL，ROX Reference Dye II0.4μL，cDNA 模板 2μL，dH2O6.8μL，總反應體系為20μL。PCR循環(huán)條件為:95℃0.5min 1個循環(huán)，95℃5s，60℃ 34s40 個循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃15s1個循環(huán)。PCR結束后，分析結果并計算，利用SDS7000軟件分析實時PCR實驗結果。

表1 目的基因的實時定量RT-PCR引物序列

1.2.10 統(tǒng)計學處理 尿碘值用尿碘中位數(shù)表示，其余數(shù)值用均數(shù)±標準差(±s)表示。2個樣本均數(shù)比較用t檢驗，2個以上樣本均數(shù)比較用方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。全部數(shù)據(jù)均輸入Excell工作表中，用 SPSS17.0軟件包做統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 血清甲狀腺激素及TSH水平

表2 補中益氣法對甲減Wistar大鼠甲狀腺功能的影響(±s)

表2 補中益氣法對甲減Wistar大鼠甲狀腺功能的影響(±s)

注:與正常對照組比較:★★P＜0.01，★★★P＜0.001;與模型對照組比較:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;與 L-T4組比較:●●P＜0.01

組 別 處理時間 例數(shù) 血清TT3(nmol/L)TT4(nmol/L)TSH(mIU/L)0d 8 1.36±0.46 68.10±8.55 0.18±0.09對照組 8周 8 1.66±0.26 72.64±23.98 0.88±0.20模型組 0d 8 0.53±0.34★★★ 17.99±1.37★★ 3.01±1.97★★對照組 8周 8 0.92±0.29★★★ 28.30±17.73★★★ 4.51±1.01★★★L-T4組 0d 8 0.59±0.12★★★ 35.03±19.38★★★ 2.71±0.52★★★8周 8 2.16±0.26△△△ 87.32±6.55△△△ 1.56±0.08△△△補 中 0d 8 0.78±0.18★★★ 18.63±1.54★★★ 2.54±0.2★★益氣組 8周 8 1.72±0.45△△ 72.97±25.75△△△ 0.93±0.03正常組△△●●

2.2 甲狀腺形態(tài)學觀察

正常組大鼠甲狀腺濾泡大小一致，呈圓形或不規(guī)則形，濾泡上皮多為立方形，濾泡腔內膠質均勻(圖1);模型組甲狀腺濾泡萎縮，上皮細胞呈高柱狀增生，濾泡腔內膠質缺少甚至消失，小血管擴張充血(圖2);治療8周后2組均有所改善，部分甲狀腺濾泡上皮逐漸變扁，補中益氣湯組與 L-T4組比較，甲狀腺濾泡略大，濾泡上皮呈低柱狀，腔內膠質較多，優(yōu)于 L-T4組(圖 3、圖 4)。

圖1 正常組8周時(HE染色×400)

圖2 模型組8周時(HE染色×400)

圖3 L-T4組8周時(HE染色×400)

圖4 補中益氣湯組8周時(HE染色×400)

2.3 尿碘結果

2.4 心電圖表現(xiàn)

表3顯示，模型組大鼠與正常組比較心率減慢，QRS波峰值電壓降低(P＜0.01)，提示心肌供血不足;治療后2組均有所改善，但2組之間比較無差異，大鼠心電圖見下圖(圖5～圖8)

表3 各組 MUI值(μg/L)

2.5 心臟指數(shù)

模型對照組大鼠心臟指數(shù)明顯高于正常對照組(P＜0.01)，其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義。

2.6 心肌細胞形態(tài)學觀察

正常組大鼠心肌細胞肌絲排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯，無細胞腫脹(圖9);模型組大鼠心肌細胞腫脹，部分胞漿溶解、消失，液化性壞死，胞漿染色淡且模糊，肌纖維斷裂，肌紋消失和間質水腫(圖10);治療8周后各組均有所改善，補中益氣湯組優(yōu)于LT4組(圖 11、圖 12)。

表4 大鼠心電圖心率、QRS波峰值電壓(±s)

表4 大鼠心電圖心率、QRS波峰值電壓(±s)

注:與正常對照組比較:★★P＜0.01;與模型對照組比較:△△P＜0.01，△△△P ＜0.001

組別 處理時間(周)例數(shù)心率(次/min)QRS波峰值電壓(mV)8 6 339±35 0.46±0.03模 型 對 照 組 8 6 230±23★★ 0.25±0.03★★L - T4 組 8 6 432±27△△ 0.53±0.18△△補中益氣湯組 8 6 476±9△△△ 0.58±0.09正常對照組△△△

表5 大鼠心臟指數(shù)(±s)

表5 大鼠心臟指數(shù)(±s)

注:與正常對照組比較:★★P＜0.01

組別 處理時間(周)例數(shù) 心臟指數(shù)(g/100g)正常對照組88 0.34±0.03 0.33±0.06模 型 對 照 組 8 8 0.38±0.04★★L - T4 組 8 8 0.35±0.04補中益氣湯組88

圖5 正常對照組心電圖

圖6 模型對照組心電圖

圖7 L-T4組心電圖

圖8 補中益氣湯組心電圖

圖9 正常組8周時(HE染色×400)

圖10 模型組8周時(HE染色×400)

圖11 L-T4組8周時(HE染色×400)

圖12 補中益氣湯組8周時(HE染色×400)

2.7 心肌組織α-MHC和β-MHC mRNA的表達

表6顯示，甲減時，心肌細胞 α-MHC mRNA表達下調，受TH負向調節(jié)的β-MHC mRNA表達量呈顯著上升。治療8周后，α-MHC mRNA表達增加，β-MHC mRNA表達量減少，補中益氣湯組均優(yōu)于LT4組。用2－ΔΔCT法來決定目的基因在各組表達的相對水平。

表6 α-MHC與β-MHCmRNA的相對表達量

3 討論

肌球蛋白是影響心肌收縮的主要結構蛋白，正常情況下，肌球蛋白存在于心肌細胞質內，是一個六聚體大分子，可分為2條重鏈(MHC)和4條輕鏈(MLC)。重鏈分為α型和β型2種，α鏈有很強的ATP酶活性，能使ATP轉化為ADP，引起心肌收縮，而β鏈的轉化能力較弱。TH能夠促進α-MHC基因的表達，抑制β-MHC基因的表達，使編碼α鏈的mRNA增多，ATP轉化為ADP的能力增強，從而提高心肌的收縮力［3，4］。甲減時，TH 分泌減少，心肌細胞α-MHC mRNA表達下調，受TH負向調節(jié)的β-MHC mRNA表達量呈顯著上升。劉桂芝［5］等人的實驗證明，大鼠長期碘缺乏會出現(xiàn)較嚴重的甲減，心肌細胞中受TH調節(jié)的靶基因α-MHC mRNA表達下調，而β-MHC mRNA表達明顯上調，導致心肌收縮力顯著減弱而影響心臟的功能。

TH的生物學作用主要是 T3與結合到DNA基因調節(jié)部位的T3受體(T3R)及其與相關蛋白的相互作用，通過調控靶基因的轉錄和表達而實現(xiàn)的。T3R在胞漿合成后，轉移到細胞核，與靶基因上的TRE(甲狀腺激素反應元件)結合，而不是像其他類固醇激素受體那樣，以激素受體復合物的形式進入細胞核。TRE常位于靶基因轉錄起始部的上游［6］。甲狀腺激素首先與心肌甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor，TR)結合，活化的受體再與甲狀腺激素調控基因上的甲狀腺激素反應元件 (thyroid hormone response element，TRE)結合，啟動甲狀腺激素調控基因轉錄。甲狀腺激素就是這樣通過TR來調控甲狀腺激素調控基因表達水平，從而發(fā)揮其正常生理調控功能，TR是甲狀腺激素發(fā)揮作用的重要橋梁［7］。

補中益氣湯為低碘含量的方劑，而非富碘方劑。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在治療癭病的中藥中，海藻、昆布為碘含量豐富的中藥即富碘中藥，其中藥飲片碘含量分別為682.46μg/kg和 794.69μg/kg，而當歸中藥飲片的碘含量僅為1.58μg/kg，當歸湯劑的碘含量也僅為31.67g/L［8］。從大鼠 MUI的數(shù)值來看，各組大鼠碘的供給量在整個實驗過程中是較恒定的，治療后補中益氣湯組大鼠的尿碘中位數(shù)并未明顯提高，可見補中益氣湯為低碘方劑，而非富碘方劑。

本實驗中，8周后甲減大鼠的心肌有了不同程度的損傷，心肌細胞腫脹，部分胞漿溶解、消失，液化性壞死，胞漿染色淡且模糊，肌纖維斷裂，肌紋消失和間質水腫，心肌 α-MHC的 mRNA表達下調，β-MHC的mRNA表達上升。與正常組比較，模型組大鼠α-MHC的mRNA表達下調0.89倍，L-T4組、補中益氣湯組分別上升1.77倍、2.32倍，補中益氣湯組上升明顯;模型組大鼠 β-MHC的 mRNA的表達上升5.66倍，L-T4組、補中益氣湯組分別下調至正常組的2.61倍、1.17倍，補中益氣湯組下調明顯。補中益氣法明顯提高甲減大鼠 TT3、TT4水平，與 L-T4療效相當，在心肌細胞形態(tài)學的恢復、調節(jié)心肌 α-MHC、β-MHCmRNA的表達上明顯優(yōu)于 L-T4，說明補中益氣法在甲減心肌損傷的修復中起重要作用，其作用機制與提高心肌α-MHCmRNA的表達、降低心肌β-MHCmRNA的表達密切相關，但是否與提高心肌TR的表達及受體后的作用有關有待于進一步研究。

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