以肽脫甲?；笧榘悬c(diǎn)的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用

張麗蓉，趙莉莉，魏玉珍，李秋萍，王莉?qū)?，余利巖

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性緩發(fā)型傳染病。結(jié)核病曾在全世界廣泛流行，奪去了數(shù)億人的生命[1]。異煙肼、利福平等藥物的使用一度使得結(jié)核病得到了很好的控制和治療，但近年來AIDS的蔓延和多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使得肺結(jié)核的防控形勢(shì)異常嚴(yán)峻，傳統(tǒng)藥物已不能滿足臨床需要[2-7]。因此，亟需加緊新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)。

肽脫甲?；福╬eptide deformylase，PDF）是原核生物蛋白質(zhì)成熟過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它在蛋白質(zhì)成熟過程中起關(guān)鍵作用，主要功能就是水解原核生物的新生多肽 N 端甲酰甲硫氨酸的甲?；?。若 PDF 發(fā)生突變或缺失，病原微生物則不能生長(zhǎng)、繁殖[8]。它在真核生物中并非必需，因此被視為理想的新一代廣譜抗生素藥物篩選分子靶點(diǎn)之一[9-10]。微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物是研制新藥的重要資源之一，天然產(chǎn)物來源的PDF 抑制劑報(bào)道很少[11-13]，這些報(bào)道的天然 PDF 抑制劑結(jié)構(gòu)多為非肽類，其抑酶活性和抗菌活性都相對(duì)其他類型的化合物要低，天然來源的結(jié)核分枝桿菌的PDF 抑制劑還未見報(bào)道。本研究通過建立以肽脫甲?；笧榘悬c(diǎn)的高通量篩選模型，期望在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新型酶抑制活性和抗菌活性均較好的抑制劑，為開發(fā)有效的新型抗耐藥結(jié)核分枝桿菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Veriti 96 well Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀為美國(guó) ABI公司產(chǎn)品；?KTA pufifierTM10 層析系統(tǒng)為美國(guó) GE Healthcare公司產(chǎn)品；PolarFluostar 多功能熒光檢測(cè)儀為德國(guó) BMG公司產(chǎn)品；三肽for-Met-Ala-Ser 為瑞士 Bachem公司產(chǎn)品；Actinonin和Fluorescamin 為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品。

菌株大腸桿菌感受態(tài) DH5α和BL21（DE3）購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；克隆載體pGEM-T easy 購(gòu)于美國(guó) Promega公司；表達(dá)載體pET-28a 由本室保存；細(xì)胞 293T、A549和Raw264.7 由本所免疫室惠贈(zèng)；結(jié)核分枝桿菌 H37Rv基因組DNA 由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所陸宇老師惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.2 蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 分別用 NdeI和XhoI 對(duì) T-def和pET-28a 進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因片段和線性化的pET-28a。用 T4 連接酶在16 ℃ 連接 20 h，連接后的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-def。并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，然后涂布于含有 50 mg/L 卡那霉素的LB 平板上。37 ℃ 培養(yǎng) 16 h 篩選重組子，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定載體的正確性，并測(cè)序驗(yàn)證片段的正確性及插入方向的正確性。

1.2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 用構(gòu)建成功的pET-28a-def 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)，接種于50 μg/ml 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5 時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于20 ℃、200 r/min 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。收獲并裂解菌體細(xì)胞，通過 SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè) PDF 在BL21 中的表達(dá)。超聲裂解菌體后的裂解液于4 ℃、15000×g 離心 30 min，上清用 0.45 μm 濾膜過濾。使用 ?KTA 系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化。

1.2.4 結(jié)核分枝桿菌 PDF 抑制劑篩選模型的建立、優(yōu)化、評(píng)價(jià)及應(yīng)用

1.2.4.1 蛋白活性測(cè)定 PDF 水解掉甲酰化三肽底物 for-Met-Ala-Ser N 端的甲?；?，N 端暴露出游離的NH2，游離 NH2與熒光胺反應(yīng)后所產(chǎn)生的熒光能夠用多功能熒光檢測(cè)儀在激發(fā)光 390 nm、發(fā)射光 470 nm下檢測(cè)，熒光強(qiáng)度的變化直接反映了酶活性的強(qiáng)弱[14]。反應(yīng)體系的總體積為50 μl，其中含有：20 ng PDF 酶、5 mmol/L 底物、0.06 mg/ml熒光胺。酶和底物用 pH 7.4的HEPES 緩沖液稀釋及配制，反應(yīng) 30 min 后加入熒光胺，繼續(xù)反應(yīng)5 min 后檢測(cè)熒光值。

1.2.4.2 篩選樣品處理 取 7ml 新鮮發(fā)酵液用等體積的丙酮抽提，離心，上清用乙酸乙酯萃取，揮干后用 DMSO 溶解。

1.2.4.3 模型的優(yōu)化和評(píng)價(jià) 本研究考察了一系列溫度（15～45 ℃）、酶濃度（10～100 ng）、底物濃度（0.1～30 mmol）以及反應(yīng)時(shí)間（2～30 min）對(duì)酶活性測(cè)定的影響，選擇最佳反應(yīng)條件，對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化。進(jìn)一步考察了 DMSO 濃度以及反應(yīng)體系中各種成分對(duì)酶活性的影響。

計(jì)算下列指標(biāo)：

1.2.4.4 孔板的穩(wěn)定性及均一性評(píng)價(jià) 將經(jīng)優(yōu)化的體系于96 孔板中進(jìn)行反應(yīng)，分別設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照交叉排列，每天進(jìn)行 1 次體系驗(yàn)證，重復(fù) 3 d。

1.2.4.5 樣品篩選 采用終濃度 1 μmol/L的放線酰胺素作為陽性對(duì)照，使用 96 孔板進(jìn)行微生物發(fā)酵樣品的篩選。樣品和陽性藥分別與酶在37 ℃ 預(yù)混合 5 min。加入底物反應(yīng) 30 min 后，再加入熒光胺，檢測(cè)熒光值大小。酶抑制率計(jì)算公式如下：

酶抑制率%=（F陰性對(duì)照均值－F樣品值）/（F陰性對(duì)照均值－F陽性對(duì)照均值）×100%

計(jì)算出的數(shù)值可能大于100%，表明樣品對(duì)PDF 酶的抑制作用強(qiáng)于陽性樣品。

1.2.5 抗恥垢分枝桿菌活性測(cè)定 采用平板紙片法（K-B 法）測(cè)定抗菌活性，用恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis mc2155）作為檢定菌。將恥垢分枝桿菌按 1.5% 接種于分枝桿菌培養(yǎng)基中，倒平板。將加有樣品的6 mm的紙片貼于平板上，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后測(cè)量抑菌圈的大小。采用異煙肼作為陽性對(duì)照，可觀察到明顯抑菌圈的被認(rèn)為是陽性樣品。異煙肼：50 μg/紙片；發(fā)酵液樣品：40 μl 發(fā)酵液/紙片。

1.2.6 樣品細(xì)胞毒性的測(cè)定 采用 MTT 法[15]來檢測(cè)篩選所得的陽性樣品對(duì)細(xì)胞存活的影響情況。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的細(xì)胞包括人腎上皮細(xì)胞 293T，人肺腺癌細(xì)胞 A549和鼠單核巨噬細(xì)胞 Raw264.7，加入的發(fā)酵液終濃度為0.5%。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：

計(jì)算出的數(shù)值可能大于100%，表明樣品中的組分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，被認(rèn)為沒有細(xì)胞毒性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆以及目的蛋白在BL21 中的表達(dá)和純化

構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng) NdeI和XhoI 雙酶切的電泳結(jié)果與預(yù)期相符，目的DNA 片段與def 基因?qū)嶋H大小（594 bp）一致。經(jīng) DNA 測(cè)序結(jié)果證明，def 基因序列和插入載體的方向均無誤，重組質(zhì)粒pET-28a-def 構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)入 pET-28a-def的BL21菌株經(jīng)過 IPTG的誘導(dǎo)，目的蛋白結(jié)核分枝桿菌PDF 得到大量表達(dá)。蛋白 SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖 1 所示。

2.2 酶活測(cè)定及藥物篩選模型的建立、優(yōu)化和評(píng)價(jià)

酶活測(cè)定結(jié)果顯示，純化所得到的PDF 酶具有較高的活性，酶與底物反應(yīng)所測(cè)得的熒光值能達(dá)到 10000 左右，可用于后續(xù)高通量篩選模型的建立。

圖1 PDF的表達(dá)和純化Figure1 Expression and purification of PDF in E.coli

2.2.1 藥物篩選模型的建立與優(yōu)化 考察了一系列溫度、酶濃度、底物濃度以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活性測(cè)定的影響（圖 2）。反應(yīng)體系經(jīng)優(yōu)化后，酶的最適反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度 37 ℃；反應(yīng)時(shí)間 30 min；PDF 酶量 20 ng；底物 for-Met-Ala-Ser終濃度5 mmol/L。

利用雙倒數(shù)作圖法，將圖 2D 轉(zhuǎn)變?yōu)?/[ν]與1/[S]的直線關(guān)系，如圖 3 所示。從直線與x 軸的截距可以得到 1/Km的絕對(duì)值，直線與y 軸的截距可得到 1/Vmax。此圖可直觀的為酶抑制研究提供易于識(shí)別的圖形。計(jì)算即可得：酶被底物飽和時(shí)的最大反應(yīng)速率Vmax=384.62 F/min，以及米氏常數(shù) Km=0.346 mmol/L。

圖2 篩選條件的優(yōu)化（A：反應(yīng)溫度優(yōu)化；B：反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化；C：酶量?jī)?yōu)化；D：底物濃度優(yōu)化）Figure2 Optimization of screening conditions (A: Optimization of reaction temperature; B: Optimization of reaction time; C:Optimization of enzyme concentration; D: Optimization of substrate concentration)

圖3 PDF 米氏常數(shù)的測(cè)定Figure3 Curve of Michaelis-Menten equation

圖4 反應(yīng)體系中各成分的影響Figure4 Effect of single component on the assay

2.2.2 藥物篩選模型的評(píng)價(jià)：

⑴反應(yīng)體系中各成分的影響 在反應(yīng)體系中分別加入緩沖液、底物和酶，檢測(cè)其對(duì)熒光值的影響，結(jié)果見圖 4。計(jì)算該模型的信噪比，S/N=32.41 ＞3，符合篩選模型的要求。

⑵DMSO 濃度對(duì)酶活性的影響 反應(yīng)體系中分別加入不同濃度梯度的DMSO，觀察對(duì)反應(yīng)體系中酶活性的影響（圖 5）。結(jié)果顯示，DMSO 低于2%時(shí)，對(duì)所測(cè)定的熒光值的影響可以忽略不計(jì)。所以，本實(shí)驗(yàn)在50 μl 反應(yīng)體系中加入 1 μl的篩選樣品。

⑶孔板穩(wěn)定性和均一性評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 6顯示，數(shù)據(jù)不存在明顯趨勢(shì)，無明顯邊緣效應(yīng)。CV陰性對(duì)照=3.78%＜20%；CV陽性對(duì)照=8.05%＜20%；Z′=0.73 ＞0.4。各項(xiàng)指標(biāo)均符合高通量模型篩選的要求。

2.3 樣品篩選結(jié)果

圖5 DMSO 濃度對(duì)酶活性的影響Figure5 Effect of DMSO concentration on enzyme activity

圖6 孔板均一性和穩(wěn)定性（A：橫向排列；B：縱向排列）Figure6 Validation of the screening assay (A: horizontal array; B: vertical array)

共篩選微生物發(fā)酵液樣品 12400 份。同時(shí)進(jìn)行酶活性的篩選和抗恥垢分枝桿菌活性的篩選，將酶水平初篩抑制率大于30%和復(fù)篩抑制率大于50%的樣品定為陽性樣品，抗菌實(shí)驗(yàn)中可觀察到明顯抑菌圈的被認(rèn)為是陽性樣品。經(jīng)過篩選，初篩得到陽性樣品 497個(gè)，占總數(shù)的4%。重復(fù) 3 次得到陽性樣品 33個(gè)，占總數(shù)的0.27%，其中 8個(gè)樣品具有抗恥垢分枝桿菌活性（表1）。

2.4 樣品細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)最終獲得的8個(gè)陽性樣品分別進(jìn)行了293T、A549和Raw264.7 細(xì)胞毒性的檢測(cè)，加入的發(fā)酵液終濃度為0.5%，計(jì)算加入樣品后的細(xì)胞存活率。如表 2 所示，每個(gè)樣品的細(xì)胞毒性有差異，而單個(gè)樣品對(duì)不同細(xì)胞的毒性也存在一定的差異性。其中，樣品 I09AA-00657、I10AA-00705和I09AB-02482的毒性較大；I08AA-01782、I09AA-02493、I09AB-00271、I09AB-02487和I09AB-02493的細(xì)胞存活率基本為70% 以上，毒性較小，值得進(jìn)一步深入研究。

表1 陽性樣品的抑酶活性及抗菌活性Table1 Inhibitory effect of positive samples

表2 陽性樣品的細(xì)胞毒性Table2 Cytotoxicity of positive samples

3 討論

PDF 對(duì)原核生物蛋白質(zhì)的成熟起著關(guān)鍵作用，而在真核生物中并非必需。PDF蛋白的結(jié)構(gòu)很保守，在所有原核生物中同源性都較高。除此之外，PDF蛋白還容易在體內(nèi)外進(jìn)行活性分析。良好的毒性選擇性和序列的保守性，以及易純化并測(cè)活等特性都使得 PDF 成為較理想的廣譜抗生素藥物篩選的分子靶點(diǎn)之一，利用本研究建立的篩選模型還有望篩選得到對(duì)其他病原微生物具有抑制活性的化合物。

本研究的電泳結(jié)果顯示，表達(dá)得到的目的蛋白大部分存在于沉淀中。嘗試了不同的誘導(dǎo)條件，可溶性蛋白表達(dá)量均沒有得到明顯改善。這可能與蛋白本身是非大腸桿菌的外源蛋白有關(guān)，其他文獻(xiàn)也有此蛋白可溶性較小的報(bào)道[16-17]。但由于本研究蛋白用量較小，反應(yīng)體系中只需加入 20 ng PDF 酶，而純化 100ml 培養(yǎng)物即可得到 0.28 mg PDF 酶，足夠 10000余個(gè)樣品篩選之用，因此本研究中沒有嘗試去進(jìn)一步提高可溶蛋白量的表達(dá)。純化得到的蛋白分子量略大于理論值（20.939 kD），可能與表達(dá)的蛋白為含有 His的融合蛋白有關(guān)，His 增加了蛋白的分子量。另外，蛋白中脯氨酸殘基的存在也可能影響蛋白在SDS-PAGE 電泳中的正常遷移，從而使得與預(yù)期值不符。

本研究篩選得到的33個(gè)酶水平陽性樣品中，只有 8個(gè)具有抗恥垢分枝桿菌活性。推測(cè)可能的原因?yàn)椋孩倩钚晕镔|(zhì)穿透細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的能力較弱，無法有效進(jìn)入菌體內(nèi)與目的蛋白作用，生物利用度低；②盡管恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌具有較近的親緣關(guān)系，但兩者的PDF 酶氨基酸序列之間還是存在一定的差異性。因此，有必要在以后的工作中，進(jìn)一步評(píng)價(jià)這 33個(gè)陽性樣品的抗結(jié)核分枝桿菌活性以及其對(duì)恥垢分枝桿菌 PDF 酶抑制活性。這 8個(gè)活性樣品中有 5個(gè)細(xì)胞毒性較小。細(xì)胞毒性較大的樣品也存在活性成分和毒性成分不同一的可能性，將通過后期的分離純化再次驗(yàn)證。

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