EGFR抑制劑細胞磷酸化篩選模型的建立與應用

紀瀟朗，于冰，金華，周祥，徐春秀，石玉，李祎亮

表皮生長因子受體（EGFR）是一種具有酪氨酸激酶（PTK）活性的跨膜糖蛋白受體，由 N 端胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū) 3 部分組成，胞內區(qū)共 542 個氨基酸殘基，由近膜區(qū)、酪氨酸激酶區(qū)、C 末端等 3 個亞區(qū)構成，近膜區(qū)的前13 個氨基酸（645～657）介導胞內二聚化[1]。自身磷酸化位點位于 C 末端，其中 Tyr1068 為最主要的 3 個磷酸化位點（Tyr1068、Tyr1148 和 Tyr1173）之一，與細胞信號傳遞密切相關[2]。表皮生長因子（EGF）與 EGFR 胞外區(qū) N 端結合，受體之間二聚化形成同源或異源二聚體，二聚體促使EGFR 胞內區(qū)氨基酸殘基自磷酸化，進而啟動胞內信號通路，調控癌細胞的增殖、存活及凋亡[3]。

EGFR 的信號轉導通路在腫瘤的形成和發(fā)展過程中占據重要地位，已成為腫瘤藥物治療的一個理想靶標。目前，利用 EGF 誘導 A431 腫瘤細胞，定量檢測腫瘤細胞膜上EGFR 的 Tyr1068 位點磷酸化水平的 cell-based ELISA 篩選方法文獻報道較少，基于作用機制的分析，本文選用EGFR 高表達的 A431 細胞系，EGFR（Tyr1068）自身磷酸化為主要的特異檢測指標，確立了 EGF 誘導 A431 細胞磷酸化的篩選條件，并用此方法系統(tǒng)評價了已上市的酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼（gefitinib）、拉帕替尼（lapatinib）以及自研的新活性化合物對 EGFR（Tyr1068）磷酸化的抑制活性，實驗結果具有較好的重現性和準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 EGF 細胞因子購自以色列 ProSpec公司；37% 甲醛、雙氧水購自美國 Sigma 公司；ELISA cell based Kit 購自美國 R & D 公司；無菌去離子水購自美國Amresco 公司；胎牛血清購自美國 Hyclone 公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司。

1.1.2 主要儀器 Costar 黑色透明底 96 孔板購自美國Corning 公司；SMP500-15418-QWGI 型酶標儀購自美國Molecular Devices 公司。

1.1.3 細胞株 A431 細胞購于北京協和醫(yī)學院細胞中心。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)、誘導及固定 細胞使用含有 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，在飽和濕度、37 ℃ 和 5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。當細胞生長至約 80%～90% 匯合時，將細胞進行 1∶2 傳代，約 2～3 d 傳代 1 次。取生長良好對數生長期細胞經胰蛋白酶消化后以優(yōu)化細胞數接種于黑色透明底 96 孔板，在飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。加入預先配置好所檢測的酪氨酸激酶抑制劑，放入 37 ℃ 細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間，加入適量 EGF 等細胞因子刺激誘導。經誘導后立即吸出孔內液體，每孔加入 100 μl 預先配好的 4% 甲醛溶液固定細胞，室溫放置 20 min。實驗均重復 5 次，并平行設置 5 個復孔。

1.2.2 細胞板封閉及抗體結合 吸出甲醛溶液，加入洗滌液洗滌，每孔 200 μl 洗液，洗滌 3 次，每次 5 min，每孔加入 100 μl 濃度為 0.6% 的 H2O2終止液，室溫放置20 min，吸取終止液，洗滌；每孔加入含 35% 胎牛血清的封閉液 100 μl，室溫放置 1 h，吸取封閉液，洗滌；每孔加入 100 μl 連接抗體混合液（羊抗總 EGFR 抗體連接膜內總蛋白，鼠抗 Phospho-EGFR 抗體連接膜內磷酸化蛋白），2～8 ℃ 孵育 16 h，吸取連接抗體混合液，洗滌；每孔加入100 μl 標記抗體混合液（連接辣根過氧化物酶及堿性磷酸酶的標記抗體，以堿性磷酸酶標記的羊抗 IgG 識別羊抗總EGFR 抗體、以辣根過氧化物酶標記的鼠抗 IgG 識別鼠抗Phospho-EGFR 抗體），室溫放置 2 h。

1.2.3 熒光檢測 吸取標記抗體混合液，經洗液及 PBS分別洗滌后，每孔加入 150 μl 顯色劑，室溫避光放置 20 ～60 min。酶標儀檢測 RFUs 值，以 540 nm/360 nm 激發(fā)光激發(fā)，600 nm/450 nm 檢測。600 nm 檢測值為 P-EGFR（Tyr1068）蛋白含量值，450 nm 檢測值為細胞總蛋白含量值。以公式：P-EGFR =（F1-B1）/（F2-B2）計算細胞內磷酸化蛋白的比率，確定細胞上總蛋白、磷酸化蛋白的含量。其中 F1 和 F2 分別為 600 nm 和 450 nm 處所測的樣品熒光強度值； B1 和 B2 分別為 600 nm 和 450 nm 處空白對照的熒光強度值。

1.2.4 EGF 細胞因子用量及誘導時間優(yōu)化 EGF 誘導刺激時間分別為 5、10、20 min，EGF 用量（包括陰性對照）設置 8 個濃度，分別為 0、5、10、20、40、80、160、320 ng/ml。根據參考文獻[4-5]及工作經驗，反應體系中A431 細胞密度設定為 10000 個/孔。

1.2.5 A431 細胞接種密度優(yōu)化 細胞用量設置 7 個濃度，分別為 80000、40000、20000、10000、5000、2500、1250 個/孔。設置添加 EGF 細胞因子與不添加 EGF 細胞因子誘導刺激細胞作對比檢測。根據已確定的 EGF 實驗條件，以反應體系中磷酸化蛋白水平確定 A431 細胞的最佳用量。

1.2.6 小分子酪氨酸激酶抑制劑透膜給藥時間的確定 設置 5 個孵育時間點，分別為 6、3、1.5、0.75、0.375 h。選用吉非替尼為陽性測試藥，添加濃度為 20 nmol/L。據已確定的反應體系條件，反應體系中 EGF 刺激時間為 10 min、用量為 100 ng/ml，A431 細胞為 10000 個/孔。

1.2.7 EGFR（Tyr1068）磷酸化抑制活性測定 取小分子酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼、吉非替尼及本實驗室自行研發(fā)的具有小分子酪氨酸激酶抑制作用的化合物進行測活。藥物設置 7 個濃度，分別為 0.1、1、5、10、100、500、1000 nmol/L。反應體系中 EGF刺激時間為 10 min、用量為 100 ng/ml，A431 細胞為 10000 個/孔，藥物孵育時間 1.5 h。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 EGF 細胞因子最佳用量及誘導時間

當 A431 細胞為 10000 個/孔時，磷酸化水平與 EGF添加量成正比例增長。EGF 誘導時間在本實驗中所設置的3 個時間點中影響差異較小。組內 3 種不同時間 EGF 誘導下，A431 細胞磷酸化差別不大，從圖 1 中觀察到 EGF在 10 min、40～160 ng/ml 濃度間表現出較其他兩組略高的斜率，磷酸化水平變化最敏感，考慮到 5 min 誘導時間在組間或不同批次 A431 細胞不同狀態(tài)下存在的誘導時間不足、磷酸化不充分等情況，因此選用 10 min、100 ng/ml 為EGF 誘導的最優(yōu)化條件。

圖1 A431 細胞經不同濃度、不同時間 EGF 誘導后磷酸化檢測值

2.2 A431 細胞最佳接種密度

經 EGF 誘導刺激 A431 細胞，該細胞磷酸化水平隨細胞量逐漸增多呈正比增長，增長較明顯。未經 EGF誘導刺激的細胞隨細胞數量增加磷酸化水平增長趨勢不明顯，不適宜用于實驗。因此，證明 A431 細胞最佳用量為10000 個/孔（圖 2）。

圖2 不同密度 A431 細胞 EGFR（Y1068）磷酸化檢測值

2.3 小分子酪氨酸激酶抑制劑透膜給藥時間的確定

由圖 3 可知，隨給藥后孵育時間延長，抑制劑對 EGFR磷酸化水平抑制率略微升高，但藥物孵育時間長短對抑制率無明顯影響。因此，選用 1.5 h 為最佳藥物孵育時間。

圖3 吉非替尼不同孵育時間對 A431 細胞 EGFR（Y1068）磷酸化抑制率

2.4 拉帕替尼、吉非替尼對 A431 細胞磷酸化抑制率及活性化合物 IC50 值

拉帕替尼、吉非替尼對 A431 細胞 EGFR（Tyr1068）磷酸化有顯著的抑制作用，其磷酸化水平隨給藥濃度增加而降低。拉帕替尼 IC50為 22.65 nmol/L；吉非替尼 IC50為11.45 nmol/L；部分活性化合物 IC50值見表 1。

表1 部分活性化合物 A431 細胞EGFR（Y1068）磷酸化的 IC50

3 討論

EGFR 是一種跨膜受體，存在至少 5 種不同的配體，其中 EGF 在細胞生長調節(jié)和分化中起重要作用[6]。研究顯示，多種實體腫瘤存在 EGFR 的高表達或突變，70% 以上生長的腫瘤細胞存在該受體及其配基，PI3K/Akt 和 Ras/Raf/MAPK 是其重要的下游信號轉導通路，與腫瘤細胞增殖、抗凋亡、血管形成、侵襲、轉移以及放化療拮抗等多種惡性生物學行為密切相關[7]。同時，越來越多的研究證實，EGFR 家族受體可進入細胞核內，并發(fā)揮更為廣泛的作用[8]。

吉非替尼及拉帕替尼均是小分子的酪氨酸激酶抑制劑，該類藥物進入細胞后作用于 EGFR 的酪氨酸激酶區(qū)域，阻斷 EGFR 信號通路[9]。本文以吉非替尼、拉帕替尼為陽性對照藥，驗證篩選條件的可行性，實驗表明，該篩選條件的實驗操作簡便，結果穩(wěn)定、可靠，并從大量活性化合物中篩選出 4 個具有良好活性的全新化合物。

本文的篩選體系有別于傳統(tǒng)的 ELISA 方法：實驗選用A431 細胞作為細胞模型，該細胞具有 EGFR 高表達特點，對 EGF 敏感性高，經 EGF 誘導刺激后自磷酸化水平顯著提高；以完整未裂解的細胞為檢測對象，無需抗體包被細胞板，可避免操作當中因包被不均勻所帶來的誤差；此外，本方法設立空白和對照，無需做標準曲線作為比對，是一種簡便、準確、快速的定量檢測體系；本方法可同時檢測出細胞EGFR 蛋白總含量及磷酸化蛋白的含量，可以量化 Western blot 法對蛋白的檢測結果。

本篩選體系對懸浮型和貼壁型細胞均適用，除選擇EGFR 高表達的 A431 細胞以外，也可用于其他細胞EGFR 的 Tyr1068 位點磷酸化水平的檢測，可廣泛地應用于多種酪氨酸抑制劑特異性的細胞水平的篩選，為酪氨酸激酶抑制劑的高通量篩選提供一種高效、簡便、準確的方法選擇。

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