胡黃連中酚類化合物的分離及UPLC-ESI-MS分析*

劉時喬 ，張新鑫 ，單 淇 ，周福軍 ，侯文彬 ，

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193，2.天津藥物研究院，天津 300193）

胡黃連為中國傳統(tǒng)中藥的清虛熱要藥，最早記于《唐本草》，具有清熱、涼血、燥濕、消疳功效，用于骨蒸勞熱、黃疸、冷熱泄痢、小兒疳積、自汗、盜汗、痔瘺和瘡腫等證的治療[1]。2010版《中國藥典》收載的胡黃連品種為西藏胡黃連（Picrorhiza scrophulariiflora Pennell）的干燥根莖。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對西藏胡黃連的化學(xué)成分進(jìn)行了的研究，從中主要分離得到3大類化合物，分別為環(huán)烯醚萜類、酚苷類和葫蘆烷類皂苷類化合物[2-3]。目前關(guān)于胡黃連中環(huán)烯醚萜類化合物的分析報道已經(jīng)較為充分，但是對于其酚類成分的分析報道很少，尚未見超高效液相色譜與電噴霧質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS）技術(shù)對胡黃連中酚類成分分析測定的報道。本實驗對胡黃連化學(xué)成分進(jìn)行了較為深入的研究，從胡黃連的乙醇提取物中獲得6個酚類化合物，分別為云杉苷（Ⅰ）、草夾竹桃苷（Ⅱ）、藏黃連酚苷A（Ⅲ）、藏黃連酚苷F（Ⅳ）、香草酸（Ⅴ）和香草乙酮（Ⅵ）。首次采用 HPLCESI-MS技術(shù)對該6個酚類成分進(jìn)行了含量測定。為胡黃連原藥材和提取物的質(zhì)量控制以及復(fù)方中的酚類化合物的研究，及合理開發(fā)利用胡黃連資源提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters ACQUITY UPLC液質(zhì)聯(lián)用色譜儀為美國Waters公司生產(chǎn)，離子源為電噴霧離子化正離子采集模式（ESI＋），毛細(xì)管電壓：3.2 kV 和電噴霧離子化負(fù)離子采集模式（ESI－），毛細(xì)管電壓：－2.8 kV。BruckAC－400P型超導(dǎo)核磁共振儀為瑞士Bruck公司生產(chǎn)，其中氫譜為400 MHz和600 MHz，碳譜為100 MHz和150 MHz。制備用高效液相色譜（HPLC）法，HPLC－ODS柱C18（250 mm×10 mm，5 μm）Agela公司生產(chǎn)，薄層硅膠及柱色譜硅膠均由青島海洋化工廠生產(chǎn)，甲醇（色譜級）和乙腈（色譜級）為Fisher公司生產(chǎn)，其余試劑均為分析純，由天津市康科德科技有限公司生產(chǎn)。

胡黃連藥材購買自河北省安國市祁澳飲片廠，按《中國藥典》2010版第一部226頁鑒定本品為玄參科植物胡黃連的干燥根莖。

2 提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 提取分離 胡黃連干燥根莖2 kg，用70%的乙醇加熱回流提取3次,每次2 h，提取液減壓濃縮回收溶劑至無醇味，經(jīng)大孔樹脂AB-8純化，水—乙醇梯度洗脫，得水洗部分、20%乙醇洗脫部分、40%乙醇洗脫部分、60%乙醇洗脫部分、80%乙醇洗脫部分等。經(jīng)預(yù)實驗，60%乙醇洗脫部分含有大量的酚類成分。故選取60%乙醇洗脫浸膏200 g，經(jīng)硅膠柱層析，三氯甲烷—甲醇梯度洗脫，所得流分再分別經(jīng)硅膠柱層析、SephadexLH-20和制備高效液相色譜（HPLC)純化，得到6個酚酸類化合物，分別為化合物Ⅰ（60 mg）、化合物Ⅱ（200 mg）、化合物Ⅲ（100 mg）、化合物Ⅳ（20 mg）、化合物Ⅴ（100 mg）和化合物Ⅵ（30 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物Ⅰ：白色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS m/z：321（M＋Na＋），297（M－H－），提示本品的分子量為 298。1H-NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.91（2H，d，J＝8.8 Hz，H－2，6），7.10（2H，d，J＝8.8 Hz，H－3，5），5.01（1H，d，J＝5.2 Hz，H－1′），3.11－4.54 為糖質(zhì)子信號；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：131.5（C－1），130.9（C －2，6），116.5（C －3，5），161.1（C －4），197.1（C－7），27.1（C－8），100.4（C－1′），73.8（C－2′），77.8（C－3′），70.3（C－4′），77.2（C－5′），61.3（C－6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[4]，鑒定該化合物為云杉苷。

化合物Ⅱ：白色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS m/z：351（M＋Na＋），327（M－H－），提示本品的分子量為328。1H-NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.46（1H，brs，H－2），7.17（1H，d，J＝8.8 Hz，H－5），7.57（1H，dd，J＝2.0，8.8 Hz，H－6），2.53（3H，s，H－8），3.82（1H，s，OCH3），5.01（1H，d，J＝5.2 Hz，H－1′），3.12－4.53 為糖質(zhì)子信號；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：130.8（C－1），111.0（C－2），150.6（C－3），148.7（C－4），114.1（C－5），122.6（C－6），197.1（C－7），27.1（C－8），100.4（C－1′），73.1（C－2′），76.8（C－3′），69.5（C－4′），77.1（C－5′），60.5（C－6′），55.6（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[4]，鑒定該化合物為草夾竹桃苷。

化合物Ⅲ：白色無定形粉末，ESI-MS m/z：663（M＋Na＋），639（M－H－），提示本品的分子量為 640。1HNMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.44（1H，d，J＝2.0 Hz，H－2），7.30（1H，dd，J＝2.0，8.4 Hz，H－5），7.14（1H，d，J＝8.4 Hz，H－6），2.47（1H，s，H－8），3.80（1H，s，OCH3），7.45（1H，d，J＝2.0 Hz，H－2′），7.18（1H，d，J＝8.4 Hz，H－5′），7.52（1H，dd，J＝2.0，8.4 Hz，H－6′），3.78（1H，s，OCH3），5.13 （1H，d，J＝7.2 Hz，H－1″），5.04（1H，d，J＝7.2 Hz，1″′），3.18－5.01 為糖上質(zhì)子；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：150.25（C－1），148.60（C－2），111.01（C －3），130.84（C －4），122.19（C －5），114.09（C－6），196.45（C－7），26.38（C－8），122.92（C －1′），112.78（C－2′），148.58（C－3′），150.74（C－4′），114.32（C－5′），122.92（C－6′），165.08（C－7′），99.50（C－1″），73.00（C－2″），76.62（C－3″），70.05（C－4″），73.90（C－5″），63.94 （C－6″），99.05 （C－1″′），73.07 （C－2″′），77.05（C －3″′），69.47（C －4″′），76.82（C －5″′），60.19（C－6″′），55.58（OCH3），55.75（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[5]，鑒定該化合物為藏黃連酚苷A。

化合物Ⅳ：白色無定形粉末，ESI-MS m/z：633（M＋Na＋），609（M－H－），提示本品的分子量為 610。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.92（1H，d，J＝8.0Hz，H－2，6），7.10（1H，d，J＝8.0 Hz，H－3，5），2.47（1H，s，H－8），7.49（1H，brs，H－2′），7.12（1H，d，J＝8.0 Hz，H－5′），7.56 （1H，dd，J＝1.2，8.0 Hz，H－6′），5.12（1H，d，J＝7.2 Hz，H－1″），5.07（1H，d，J＝7.8 Hz，1″′），3.84 （1H，s，OCH3），3.18－5.01 為糖上質(zhì)子 ；13CNMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：131.2（C－1），130.8（C－2，6），116.3（C－3，5），161.6（C－4），196.5（C－7），26.9（C－8），123.2（C－1′），112.8（C－2′），149.0（C－3′），151.2（C－4′），114.8（C－5′），123.3（C－6′），165.6（C－7′），56.2（OCH3），99.9（C－1″），73.5（C－2″），77.6（C－3″），70.2（C－4″），77.2（C－5″），63.5（C－6″），99.7（C－1″′），73.6（C－2″′），77.5（C－3″′），69.9（C－4″′），77.0（C－5″′），60.6（C－6″′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[5]，鑒定該化合物為藏黃連酚苷F。

化合物Ⅴ：白色針狀結(jié)晶（丙酮），ESI-MS m/z：169（M＋H＋），167（M－H－），提示本品的分子量為 168。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.45（1H，d，J＝1.6 Hz，H－2），6.84（1H，d，J＝8.4 Hz，H－5），7.45（1H，dd，J＝1.6，8.4 Hz，H－6），3.80（1H，s，OCH3）；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：122.3（C－1），115.7（C－2），151.7（C－3），147.9（C－4），113.4（C－5），124.1（C－6），167.9（C－7），56.2（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[4]，鑒定該化合物為香草酸。

化合物Ⅵ：白色針晶（甲醇），ESI－MS m/z：167（M＋H＋），165（M－H－），提示本品的分子量為 166。1HNMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：δ7.11（1H，d，J＝1.6 Hz，H－2），δ6.14（1H，d，J＝8.4 Hz，H－5），δ7.29（1H，dd，J＝1.6，8.4 Hz，H－6），δ3.60（3H，s，OCH3），δ2.27（3H，s，H－8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[4]，鑒定該化合物為香草乙酮。

3 HPLC-ESI-MS檢測

3.1 檢測條件 儀器：Waters ACQUITY UPLC液質(zhì)聯(lián)用儀及紫外檢測器，色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），預(yù)柱：Phenomenex,AJ0-4287，流動相：A為0.5%冰醋酸水相，B為乙腈相，進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件前6 min，A成線性由92%變到90%，隨后6～12 min，A成線性由90%變到87%并保持該比例再洗脫3 min，隨后的2 min內(nèi)A成線性由87%變?yōu)?2%，隨后的3 min內(nèi)A成線性由82%變?yōu)?5%，在隨后的5 min內(nèi)A成線性由75%變?yōu)?%，最后1min內(nèi)A由5%成線性變?yōu)?2%；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：275 nm。

質(zhì)譜條件：用電噴霧離子化正離子采集模式（ESI＋），m/z范圍：150～800 amu，毛細(xì)管電壓 3.2 kV，用電噴霧離子化負(fù)離子采集模式（ESI－），m/z范圍：150～800 amu，毛細(xì)管電壓-2.8 kV，離子源溫度：110℃，氣化溫度：350℃，脫溶劑氣：700 L/h，錐孔反吹氣50 L/h，錐孔電壓：20 V。

3.2 樣品處理 將胡黃連藥材粉碎，稱取5 g，用8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，過濾，合并提取液后減壓回收制得濃度為生藥1 g/mL胡黃連提取液。參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，將上述藥液以1 BV/h上樣體積流量通過徑高比1∶9的AB-8型大孔樹脂，依次用水、20%、40%、60%及80%的乙醇洗脫各4柱體積，選取60%乙醇洗脫部分，蒸干稱質(zhì)量，精密加入50%甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，過0.45 μm微膜，濾液直接進(jìn)入色譜分析系統(tǒng)分析，進(jìn)樣量為5 μL。

3.3 對照品溶液的制備 精密稱取云杉苷、草夾竹桃苷、藏黃連酚苷A、藏黃連酚苷F、香草酸和香草乙酮對照品，精密加入50%的甲醇制成0.1 mg/mL的溶液，過0.45 μm微膜，濾液直接進(jìn)入色譜分析系統(tǒng)分析，進(jìn)樣量為5 μL。

3.4 胡黃連藥材UPLC-ESI-MS分析及含量測定 在本實驗的色譜條件下，胡黃連中6個酚性成分獲得了較為良好的基線分離。在總離子流色譜和紫外色譜中可以觀察到該6個標(biāo)記峰如圖1，峰1的特征離子為 321，137（ESI＋），峰 2 的特征離子為 351,167（ESI＋），峰 3 的特征離子為 169（ESI＋），167（ESI－），峰 4 的特征離子為 167（ESI＋），165（ESI－），峰 5 的特征離子為633，313（ESI＋），峰6的特征離子為663，313（ESI＋）。圖2為 6 個標(biāo)記峰的質(zhì)譜圖。其中峰1的特征峰為分子離子峰321[M+Na]+，137[MGlucoside+H]；峰2的特征峰為分子離子峰351[M+Na]+，167[M－Glucoside+H]；峰 3 特征離子為分子離子峰169[M+H]+和167[M－H]-；峰4的特征峰為分子離子峰167[M+H]+和165[M－H]-；峰5的特征峰為分子離子峰 633[M+Na]+，313[M－Glucoside－香草乙酮碎片+H]；峰6的特征峰為分子離子峰663[M+Na]+，313[M－草夾竹桃苷+H]。以上6個酚類成分的含量結(jié)果見圖1。

4 討論

4.1 流動相的選擇 在建立分析方法的過程中以乙腈、冰醋酸水為流動相，用等度方法無法同時分離上述6種物質(zhì)，因此改成梯度淋洗方法。為得到較好的峰型，需要確定梯度下加酸的比例，經(jīng)反復(fù)摸索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入0.5%的冰醋酸或0.05%的磷酸時效果最佳。但是磷酸為非揮發(fā)性酸，污染質(zhì)譜檢測器的離子源，因此選擇向流動相中添加冰醋酸。

圖1 胡黃連60%乙醇洗脫部分的UPLC-UV和UPLC-ESI-MS色譜圖Fig.1 UPLC-UV and UPLC-ESI-MS chromatogram of Picrorhiza scrophulariiflora Pennell in 60%alcohol elution part

圖2 化合物Ⅰ～Ⅵ的ESI+質(zhì)譜圖Fig.2 ESI+chromatogram of compoundsⅠ～Ⅵ

表1 化合物Ⅰ～Ⅵ的含量測定結(jié)果Tab.1 Results of assaying of compoundsⅠ～Ⅵ

4.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 未來使各個物質(zhì)都能達(dá)到最佳的質(zhì)譜響應(yīng)，優(yōu)化的質(zhì)譜條件包括溶劑氣溫度、離子源溫度、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、脫溶劑氣流速度。實驗證明：脫溶劑氣流速度、離子源溫度、脫溶劑氣溫度對化合物的響應(yīng)的影響比較小。錐孔電壓是主要的影響因素，隨著錐孔電壓的升高，總離子流響應(yīng)增強，分子離子峰的降低，當(dāng)電壓值達(dá)到20 V時，準(zhǔn)分子離子峰達(dá)到最強。所以再選擇離子模式時，錐孔電壓設(shè)為20 V。

3.5.3 離子源電離模式的選擇 分別采用正離子和負(fù)離子兩種模式對上述化合物進(jìn)行掃描，在正離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰均為[M+Na]+，在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰均為[M-H]-。但是正離子模式較負(fù)離子模式更靈敏，因此選擇了正離子模式。

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