不同動物源性鏈球菌的耐藥性分析

趙 晴，孔令聰，馬紅霞，2，高云航，林雁春

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118;2.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

鏈球菌是臨床上常見的病原菌之一，其中豬源鏈球菌是一種重要的人畜共患病的病原［1］，牛源鏈球菌感染極大地增加了奶牛乳房炎的治療成本，被稱為奶牛業(yè)的“致命殺手”。隨著抗菌藥物在治療中的不合理應(yīng)用，特別是某些抗菌藥物被作為飼料藥物添加劑使用，導(dǎo)致多重耐藥性鏈球菌菌株不斷出現(xiàn)，且耐藥率高、耐藥譜廣，不僅給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了非常嚴重的經(jīng)濟損失，而且加劇了抗菌藥物在動物體內(nèi)的殘留，嚴重危害了動物食品安全［2］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)控株 鏈球菌CVCC3307，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 菌株 于2010年10月至2011年8月從吉林地區(qū)分離獲得28株動物源性鏈球菌。

1.1.3 藥品及試劑 青霉素、紅霉素、新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、克林霉素7種抗菌藥物均由北京海洋醫(yī)化生物科技有限公司惠贈。Tryptone(Typical analysis)、Yeast Extract(Typical analysis)為Oxoid公司產(chǎn)品;特級犢牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品;瓊脂粉為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;氯化鈉、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.4 主要儀器 HS－840u型水平層流單人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，SHA－B國華企業(yè)恒溫振蕩器(國華科學(xué)儀器有限公司)，AUY220型電子天平(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 血瓊脂培養(yǎng)基按參考文獻［3］進行配制。

1.2.2 病原菌的分離鑒定 分別將疑似豬源鏈球菌感染的病豬病變器官(心、肝、脾、肺)、膿汁鼻液及患有奶牛乳房炎病牛的乳液接種于血清瓊脂板中進行增菌培養(yǎng)18～24 h。取培養(yǎng)后的疑似菌落進行革蘭氏染色鏡檢，如鏡檢發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陽性菌并呈鏈球狀排列時，進行進一步純培養(yǎng)并觀察其菌落形態(tài)，最后通過生化試驗鑒定其為鏈球菌屬。

1.2.3 菌落計數(shù) 采用常規(guī)方法進行菌落計數(shù)［4］。

1.2.4 抗菌藥物的制備 青霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、多西環(huán)素用蒸餾水溶解稀釋，其中青霉素現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋至12.80256 IU;紅霉素先用少量乙醇溶解，再用pH 7.8緩沖液稀釋;氟苯尼考先用甲醇溶解，再用蒸餾水稀釋。以上藥物稀釋至7680 μg/mL。新諾明先用0.1%NaOH溶液溶解，再用蒸餾水稀釋至 122880 μg/mL。

1.2.5 瓊脂二倍稀釋法測定28株鏈球菌的MIC將已制備好的抗菌藥物用生理鹽水進行倍比稀釋，制備含藥瓊脂。將純培養(yǎng)菌制成懸液，根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果，將菌液稀釋成適當濃度(1×104～5×105CFU/mL)范圍內(nèi)，分別接種于含藥瓊脂板上37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察細菌生長情況，確定7種抗菌藥物對28株鏈球菌的MIC，進行3次重復(fù)，按美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)的標準判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鏈球菌的分離鑒定 通過鏡檢、生化試驗鑒定共分離鑒定得到18株豬源鏈球菌及10株牛源鏈球菌，分別采自長春、吉林、四平、松源、九臺、德惠等地區(qū)豬場及雙陽、九臺、吉林、四平、公主嶺、梅河等地區(qū)奶牛場。

2.2 7種抗菌藥物對28株不同動物源性鏈球菌的MIC(表1) 瓊脂二倍稀釋法測定28株鏈球菌的MIC結(jié)果顯示，從吉林省地區(qū)分離的28株動物源性鏈球菌表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，耐藥水平較高。對紅霉素的MIC為敏感株的100倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的57.14%，對克林霉素的MIC為敏感株的100倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的53.57%，對青霉素的MIC為敏感株的100倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的35.71%，對多西環(huán)素的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的75%，對新諾明的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的67.85%，對環(huán)丙沙星的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的53.57%，對氟苯尼考的MIC為敏感株的10倍以上的受檢菌株占總菌株數(shù)的14.28%。

表1 7種抗菌藥物對28株動物源性鏈球菌的MIC μg/mL

2.3 動物源性鏈球菌對7種抗菌藥物的耐藥譜(圖1)28株受檢菌株絕大多數(shù)為多重耐藥株。對2種抗菌藥物耐藥的菌株占7.14%，對3種抗菌藥物耐藥的菌株占10.31%，對4種抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%，對5種抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%，對6種抗菌藥物耐藥的菌株占14.28%，對7種抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%。

圖1 動物源性鏈球菌對7種抗菌藥物的耐藥譜

2.4 動物源性鏈球菌對7種抗菌藥物的耐藥率(圖2)28株動物源性鏈球菌對青霉素的耐藥率最高(92.86%)，其次為多西環(huán)素和環(huán)丙沙星(82.14%)、新諾明(75%)、紅霉素(67.86%)、克林霉素(57.14%)，耐藥率最低的為氟本尼考(35.17%)。

圖2 動物源性鏈球菌對7種抗菌藥物的耐藥率

3 討論

采用瓊脂二倍稀釋法檢測動物源性鏈球菌對7種抗菌藥物敏感性的結(jié)果表明，28株不同動物源性鏈球菌中，僅一株為臨床分離藥物敏感株，其他菌株均對2種以上抗菌藥物耐藥，對5種以上抗菌藥物耐藥的菌株占21.43%，絕大多數(shù)呈多重耐藥性。受檢菌株對氟苯尼考的耐藥性相對較低，這可能與氟苯尼考投入獸醫(yī)臨床的時間相對較短，使用頻率相對較低有關(guān)。這種耐藥情況與國內(nèi)外相關(guān)報道結(jié)果基本一致。Marie等［5］分別檢測了從法國臨床病豬及不同國家病人體內(nèi)分離的豬鏈球菌，對于臨床常用的13種抗菌藥物進行耐藥性檢測，檢測結(jié)果表明，耐藥性最為嚴重的是多西環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。Dong等［6］檢測了從韓國屠宰豬體內(nèi)分離得到的豬鏈球菌對于臨床常用的7種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果表明，對四環(huán)素、慶大霉素和大觀霉素均耐藥。楊曉莉等［7］在寧夏地區(qū)分離得到奶牛乳房炎鏈球菌，并做了耐藥性檢測，結(jié)果顯示，沒有對17種藥物都敏感的菌株和單藥耐藥菌株，對6種以上抗菌藥物耐藥的菌株占90%。

研究結(jié)果表明，受檢豬源鏈球菌對紅霉素耐藥水平高(MIC＞512 μg/mL)，但對青霉素耐藥水平較低，可能是某些養(yǎng)殖場為了預(yù)防豬肺疫等疾病，將大環(huán)內(nèi)酯類藥物作為飼料藥物添加劑進行飼喂，導(dǎo)致豬源鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥水平升高。受檢牛源鏈球菌對青霉素耐藥水平高(MIC＞512 μg/mL)，但對紅霉素敏感，其結(jié)果可能與第四代頭孢菌素類抗感染藥物的廣泛使用有關(guān)，導(dǎo)致β－內(nèi)酰胺類藥物耐藥水平增高。動物源性病原菌的耐藥譜及耐藥水平可能發(fā)生時間性地變遷，即長期使用某種抗菌藥物造成高度耐藥后，停止使用該類藥物一段時間后，細菌可能恢復(fù)對該類藥物的敏感性。建議臨床用藥時可以更替選擇病原菌敏感藥物進行相應(yīng)疾病治療。

吉林省不同動物源性鏈球菌耐藥性檢測結(jié)果提示，目前吉林省部分地區(qū)豬鏈球菌病可選用青霉素治療，鏈球菌所致的奶牛乳房炎可選用紅霉素或克林霉素治療，也可選用受試菌均較敏感的氟苯尼考進行該疾病的治療。因上述受試菌的采集地有限，建議在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)通過藥敏試驗篩選有效的抗菌藥物進行鏈球菌病的治療以杜絕濫用藥物，從而減少耐藥性的直接和間接傳播。設(shè)法研制鏈球菌多重耐藥抑制劑，延長抗菌藥物的使用時間已迫在眉睫［8－9］。

［1］ 劉荻萩，李艷華，蔡雪輝，等.鏈球菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的作用機制［J］.國外醫(yī)藥(抗生素分冊)，2007，28(3):103 －107.

［2］ Dziva F，Muhairwa A P，Bisgaard M.Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida［J］.Veterinary Microbiology，2008，128(1/2):1 －22.

［3］ 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:1340.

［4］ 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:1649－1650.

［5］ Marie J，Morvan H，Berthelot－ Heraultf，et al.Antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from swine in France and from humans in different countries between 1996 and 2000［J］.J Antimicrob Chemother，2002，50(2):201 －209.

［6］ Han D U，Choi C，Ham H J，et al.Prevalence，capsular type and antimicrobialsusceptibility ofStreptococcussuisisolated from slaughter pigs in Korea［J］.Can J Vet Res，2001，65(3):151 －155.

［7］ 楊曉莉，王桂琴，侯鵬霞，等.奶牛乳房炎鏈球菌分離鑒定及藥敏試驗［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，(10):56 －57.

［8］ 馬紅霞，鄧旭明，李乾學(xué)，等.吉林省動物病原性大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測試驗［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，23(4):85－88.

［9］ 馬紅霞，賈紹娟，劉玉堂，等.不同動物源性大腸桿菌的耐藥性檢測［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44(6):81 －83.