脂多糖與干擾素α聯(lián)用誘導(dǎo)白血病U937細(xì)胞凋亡及其機(jī)制*

邱元秀 王曉桃 莫東華

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的一種跨膜蛋白受體，表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞，在多種血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)[1]。內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是Toll樣受體的主要外源性配體，LPS須與其受體結(jié)合后才能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生效應(yīng)。Lehner等[2]研究表明TLRs的主要外源性配體LPS和干擾素（IFN）-α共同作用于急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1時(shí)，有協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并檢測(cè)到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-8的活性及Fas/CD95的表達(dá)明顯增高。本研究探討LPS與IFN-α聯(lián)用對(duì)白血病U937細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用及其對(duì)caspase-8的調(diào)節(jié)作用，為尋找和開發(fā)TLR激動(dòng)劑或TLR配體臨床免疫治療白血病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI-1640干粉、Trizol試劑（美國(guó)Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青）、噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）、DMSO（杭州雙林）、逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（大連寶生物工程有限公司）、各引物序列均由上海博亞公司設(shè)計(jì)和合成，F(xiàn)luor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)分析儀器（美國(guó)Alpha Innotech公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人AML細(xì)胞系U937由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)傳代引進(jìn)后，常規(guī)離心棄上清液，復(fù)蘇后的細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清，青霉素、鏈霉素各1×105U/L），置37℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液。本實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，根據(jù)處理細(xì)胞藥物的不同將實(shí)驗(yàn)組分為單用2 000 U/mL IFN-α（IFN-α組）、200 μg/L LPS（LPS組）及 2 000 U/mL IFN-α+200 μg/L LPS處理（聯(lián)合組）；對(duì)照組不加任何藥物處理細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 采用MTT還原法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×105/L，將細(xì)胞加入96孔平底培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組每組各重復(fù)5個(gè)平行孔，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL。置于37℃、含5%的CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24、48 h后從培養(yǎng)箱中取出，每孔加入MTT（5 g/L）10 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后取出，2 000 r/min離心10 min后吸去上清液，每孔再加入DMSO 100 μL，充分將培養(yǎng)板震蕩均勻5 min左右使結(jié)晶溶解，選擇490 nm波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值]/對(duì)照組A值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 收集各組藥物處理后培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞，以PBS緩沖液清洗2次后再將細(xì)胞沉淀充分混勻，用70%的冷乙醇4℃固定24 h以上。離心去除乙醇固定液，用PBS清洗1次后，加入200 mg/L去DNA酶的RNA酶，然后用流式細(xì)胞儀分析不同DNA含量的細(xì)胞分布。應(yīng)用ModifitL TL 1.00（MAC）分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，低于G1期的細(xì)胞（亞G1期）為凋亡細(xì)胞，其占細(xì)胞總數(shù)的比例為凋亡細(xì)胞比例。

1.5 RT-PCR檢測(cè)caspase-8 mRNA的表達(dá) 根據(jù)流式結(jié)果選擇凋亡率明顯的48 h進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。收集各組U937細(xì)胞，按Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，使用分光光度儀檢測(cè)RNA的濃度與質(zhì)量，要求A260nm/A280nm在2.0左右進(jìn)行純化和鑒定。取總RNA約2 μg隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體積為20 μL，取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL cDNA按試劑盒說明書提示的步驟進(jìn)行擴(kuò)增。引物的設(shè)計(jì)與合成是利用Oligo軟件由上海博亞公司完成。caspase-8引物序列：上游5′-CT GCTGGGGATGGCCACTGTG-3′；下游5′-TCGCCTCGAGGAC ATCGCTCTC-3′，擴(kuò)增片段366 bp。β-actin引物序列：上游5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACT-3′； 下 游5′-GTCACGCACG ATTTCCCGCT-3′，擴(kuò)增片段150 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，caspase-8、β-actin分別為40、35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)完畢，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，電泳完畢后在Fluor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)分析儀器下進(jìn)行觀察并分析。試驗(yàn)重復(fù)3次。目的基因mRNA表達(dá)量=每例標(biāo)本目的基因的平均灰度值/同一標(biāo)本β-actin的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），且聯(lián)合組較IFN-α組、LPS組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率變化明顯（均P<0.01），見表1。

Table 1 Effects of different drugs on inhibitory rate,apoptotic rate and expression of caspase-8 mRNA of U937 cells表1 不同藥物作用U937細(xì)胞的抑制率、凋亡率和caspase-8 mRNA表達(dá)

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），且聯(lián)合組較IFN-α組、LPS組細(xì)胞凋亡率變化明顯（均P<0.01），見表1。

2.3 各組細(xì)胞caspase-8 mRNA表達(dá)水平比較 RTPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示藥物處理U937細(xì)胞后caspase-8 mRNA的表達(dá)明顯增多，且IFN-α+LPS組較IFN-α組、LPS組caspase-8 mRNA表達(dá)值變化明顯（均P<0.01），見圖1、表1。

Figure 1 The expression of caspase-8 mRNA detected by RT-PCR圖1 RT-PCR檢測(cè)caspase-8 mRNA的表達(dá)水平

3 討論

隨著免疫研究的進(jìn)展，免疫治療在血液腫瘤治療中的作用受到重視。最近白血病的免疫治療方案中已包含TLRs激動(dòng)劑，利用TLRs在腫瘤細(xì)胞表達(dá)差異的特性作為靶點(diǎn)的免疫治療已逐漸引起關(guān)注[3]。TLRs在絕大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤中均有不同程度的表達(dá)，可表達(dá)于B系淋巴瘤細(xì)胞、B系慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，并且發(fā)揮一定生物學(xué)效應(yīng)。不同的TLRs通過識(shí)別相應(yīng)不同的病原相關(guān)分子模式，在防御外來微生物入侵的先天性免疫過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，并被視為聯(lián)系固有免疫與獲得性免疫的橋梁。

Huang等[4]研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞上用TLR配體LPS激活TLR4信號(hào)途徑可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。Hammadi等[5]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TLR7激動(dòng)劑作用于B系慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及生長(zhǎng)抑制增強(qiáng)。干擾素具有廣泛的抗腫瘤活性，目前已被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的輔助治療，并且在與其他藥物聯(lián)合使用治療白血病方面也有一定的進(jìn)展。劉加軍等[6-7]的研究結(jié)果表明IFN-α能抑制單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且與阿糖胞苷聯(lián)合應(yīng)用對(duì)白血病K562細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。本研究結(jié)果顯示IFN-α、脂多糖聯(lián)用作用于U937細(xì)胞24、48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡率較對(duì)照組升高，且兩者聯(lián)用較單用IFN-α、脂多糖細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡率變化更明顯。Caspase家族是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶家族，caspase-8是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中的重要啟動(dòng)因子，主要參與由死亡受體(Fas、DR4和DR5等)介導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡途徑，在死亡受體Fas介導(dǎo)的信號(hào)通路中,Fas與其配體偶聯(lián)后招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白并激活T細(xì)胞內(nèi)凋亡啟動(dòng)酶caspase-8分子,活化的caspase-8可通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的凋亡效應(yīng)蛋白酶分子而促使細(xì)胞凋亡[8-9]。Lehner等[2]研究報(bào)道IFN-α、LPS聯(lián)用能明顯增強(qiáng)白血病細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是LPS處理白血病細(xì)胞后啟動(dòng)TLRs發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)抗白血病效應(yīng)；也可能是兩者聯(lián)用作用于細(xì)胞后激活細(xì)胞內(nèi)外多條信號(hào)通路，導(dǎo)致caspase-8等活化進(jìn)一步加強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞外凋亡途徑加強(qiáng)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞凋亡[10]。在本研究中，藥物作用U937細(xì)胞48 h后，caspase-8 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組升高，且兩者聯(lián)用較單用IFN-α、脂多糖變化明顯，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上，LPS與IFN-α聯(lián)用對(duì)白血病細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，其凋亡機(jī)制可能與caspase-8的激活有關(guān)，這可能是其抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

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