XPD和P53對(duì)HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒X蛋白表達(dá)的影響*

丁 浩 張吉翔

人著色性干皮病基因D（xeroderma pigmentosum D，XPD）是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH（transcription factorⅡH，TFⅡH）的一個(gè)重要組分[1]。已有的研究顯示,XPD除在TFⅡH介導(dǎo)的核苷酸切除修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用外,還參與細(xì)胞的增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生[2]。有研究表明，乙肝病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein，HBx）能通過P53的介導(dǎo)抑制XPD的表達(dá)[3]，但XPD是否能通過P53的介導(dǎo)來影響HBx的表達(dá)目前鮮見相關(guān)報(bào)道。本研究將人XPD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15，并給予P53抑制劑Pifithrin-α處理，探討XPD與P53兩者對(duì)肝癌細(xì)胞增殖以及HBx、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科張軼俊博士惠贈(zèng)。培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Hyclone公司。胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，pEGFP-N2/XPD已通過PCR反應(yīng)、酶切及基因測(cè)序三重鑒定[4]。LipofectamineTM2000和Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。Pifithrin-α購(gòu)自Sigma公司。G418和MTT購(gòu)自Solarbio。DMSO購(gòu)自Amresco。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。引物由Generay Biotech合成。2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈?gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。一抗XPD、HBx、Bcl-2、Bax和β-actin購(gòu)自Santa Cruz公司。二抗辣根過氧化物酶IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和Pifithrin-α的處理 將HepG2.2.15置于含10%胎牛血清、雙抗（100 U/mL的青霉素和100 mg/L的鏈霉素）和400 mg/L G418的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和空氣濕度和5%的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。以1×105/孔的密度將細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，24 h后細(xì)胞融合率約為90%。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD和空載質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒每孔4.0 μg，脂質(zhì)體每孔10 μL介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第2天給予20 μmol/L的Pifithrin-α孵育24 h。根據(jù)處理因素的不同分為5組，1組：空白對(duì)照組；2組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2；3組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD；4組：pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α；5組：Pifithrin-α。孵育結(jié)束后收獲細(xì)胞。

1.3 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞總RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄參照試劑說明書進(jìn)行操作。各基因引物序列和產(chǎn)物大小，見表1。PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 500 ng，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,補(bǔ)去離子水至終體積 25 μL。按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)，94℃5 min；PCR反應(yīng)，35個(gè)循環(huán)，94℃ 40 s，56 ℃ 40 s,72℃ 55 s；延伸，72℃7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用暗箱式紫外透射儀觀察電泳結(jié)果并拍照。結(jié)果用BANDLEAD 3.00軟件，以目的條帶/β-actin的光密度值進(jìn)行分析。

Table 1 Gene primer sequence and product size表1 各基因引物序列和產(chǎn)物大小

1.4 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 用RIPA法取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取100 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上,脫脂奶粉溶液4℃封閉過夜。膜分別用按相應(yīng)比例稀釋的XPD、HBx、Bcl-2、Bax和β-actin的一抗孵育,4℃過夜,二抗孵育2 h,DAB顯色照相。結(jié)果用Quantity One 4.62軟件,以目的條帶/β-actin的灰度值進(jìn)行分析。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 將細(xì)胞種植在96孔板中，空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩15 min，酶標(biāo)儀（Labststems，芬蘭）測(cè)定492 nm處各孔吸光度（A）值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)處理后，用胰酶消化收集上述各組細(xì)胞。采用碘化丙啶單染法，應(yīng)用FACSCalibar流式細(xì)胞儀（Beckton Dickinson公司，USA）分析細(xì)胞周期，得出細(xì)胞各周期的百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組mRNA表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組和pEGFP-N2組相比，pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染明顯增加了XPD mRNA的表達(dá)；與空白對(duì)照組和pEGFP-N2組相比，pEGFP-N2/XPD組的HBx和Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯減少，Bax mRNA的表達(dá)明顯增多；與空白對(duì)照組相比，Pifithrin-α組的HBx和Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯增多，Bax mRNA的表達(dá)明顯減少；與pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的HBx和Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯增多，Bax mRNA的表達(dá)明顯減少；而空白對(duì)照組與pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1、表2。

Figure 1 Electrophoresis of PCR圖1 PCR電泳圖

Table 2 Comparison of mRNA Expressions between gene groups表2 各組基因mRNA表達(dá)的比較 （±s，n=6）

Table 2 Comparison of mRNA Expressions between gene groups表2 各組基因mRNA表達(dá)的比較 （±s，n=6）

**P<0.001

組別1組2組3組4組5組F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）（3）∶（4）（1）∶（5）XPD 0.685±0.080 0.695±0.066 1.779±0.081 1.787±0.145 0.609±0.101 234.221**0.864<0.001<0.001 0.883 0.195 Bax 0.850±0.194 0.831±0.100 2.172±0.347 1.354±0.223 0.365±0.083 63.100**0.881<0.001<0.001<0.001 0.001 Bcl-2 0.664±0.164 0.673±0.107 0.096±0.030 0.612±0.110 1.455±0.381 36.135**0.940<0.001<0.001<0.001<0.001 HBx 0.648±0.148 0.643±0.097 0.183±0.087 0.543±0.106 1.136±0.242 31.958**0.952<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2 各組蛋白表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組和pEGFP-N2組相比，pEGFP-N2/XPD組的轉(zhuǎn)染明顯增加了XPD蛋白的表達(dá)，HBx和Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯減少，Bax蛋白的表達(dá)明顯增多；與空白對(duì)照組相比，Pifithrin-α組的HBx和Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增多，Bax蛋白的表達(dá)明顯減少；與pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的HBx和Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增多，Bax蛋白的表達(dá)明顯減少；而空白對(duì)照組與pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、表3。

Figure 2 Electrophoresis of protein SDS-PAGE圖2 蛋白SDS-PAGE電泳圖

Table 3 Comparison of protein expression between gene groups表3 各基因蛋白表達(dá)的比較 （±s，n=6）

Table 3 Comparison of protein expression between gene groups表3 各基因蛋白表達(dá)的比較 （±s，n=6）

**P<0.001

組別1組2組3組4組5組F P （1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）（3）∶（4）（1）∶（5）XPD 0.025±0.009 0.032±0.011 0.655±0.188 0.685±0.144 0.037±0.008 65.532**0.911<0.001<0.001 0.628 0.841 Bax 0.807±0.110 0.847±0.189 1.652±0.319 0.968±0.179 0.236±0.081 40.825**0.719<0.001<0.001<0.001<0.001 Bcl-2 0.439±0.147 0.548±0.126 0.055±0.025 0.651±0.138 1.186±0.361 26.763**0.341 0.002<0.001<0.001<0.001 HBx 0.728±0.213 0.774±0.138 0.049±0.035 0.555±0.194 1.559±0.267 50.907**0.674<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3 細(xì)胞增殖活力的變化 pEGFP-N2/XPD組的A值明顯低于空白對(duì)照組和pEGFP-N2組；Pifithrin-α組的A值明顯高于空白對(duì)照組；pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的A值明顯高于pEGFP-N2/XPD組；而空白對(duì)照組與pEGFP-N2組之間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

2.4 細(xì)胞周期的變化 與空白對(duì)照組和pEGFP-N2組相比，pEGFP-N2/XPD組的G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少；與空白對(duì)照組相比，Pifithrin-α組的G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞明顯增多；與pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α組的G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞明顯增多；而空白對(duì)照組與pEGFP-N2組之間相比，G1期細(xì)胞和S期細(xì)胞差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

Table 4 Comparison of the cell proliferation and periodic variation between cell groups表4 各組細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞周期變化比較（±s，n=6）

Table 4 Comparison of the cell proliferation and periodic variation between cell groups表4 各組細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞周期變化比較（±s，n=6）

**P<0.001

組別 細(xì)胞周期1組2組3組4組5組F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）（3）∶（4）（1）∶（5）細(xì)胞增殖活力（A值）0.655±0.136 0.633±0.119 0.114±0.055 0.528±0.076 0.934±0.201 64.783**0.680<0.001<0.001<0.001<0.001 G1（%）81.15±2.31 80.81±1.88 91.08±2.90 79.75±1.79 74.78±2.01 42.985**0.794<0.001<0.001<0.001<0.001 S（%）14.10±1.74 14.61±1.97 8.60±2.53 16.52±1.91 18.25±1.73 19.954**0.662<0.001<0.001<0.001 0.001

3 討論

TFⅡH是一個(gè)由9個(gè)亞基（XPB，XPD，P62，P52，P44，P34，cdk7，cyclinHT和MATl）組成的多酶復(fù)合物，XPD作為一個(gè)支架，介導(dǎo)著復(fù)合物內(nèi)部的連接[5]。XPD具有單鏈DNA解旋酶活性，參與了核酸剪切修復(fù)，其功能缺陷可導(dǎo)致突變的基因不能得到有效的修復(fù)，同時(shí)也會(huì)影響一些癌基因和抑癌基因的功能，從而促使腫瘤的發(fā)生[6]。而且筆者既往的研究顯示，XPD基因能抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[7]。

p53基因有野生型和突變型，野生型是公認(rèn)的抑癌基因。野生型p53是某些細(xì)胞內(nèi)DNA損傷無法修復(fù)時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要調(diào)控基因，在維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、抑制惡性增殖過程中起著重要作用，其缺失和變異與多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，XPD能與P53結(jié)合并作用于P53，從而參與了P53誘導(dǎo)的凋亡過程[9]。而P53是否也參與了XPD誘導(dǎo)的凋亡過程尚有待于證實(shí)。原癌基因HBx能通過P53使得肝細(xì)胞的XPD表達(dá)下調(diào)[3]。

為此，本研究將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15使得XPD表達(dá)增高，并給予Pifithrin-α抑制P53，然后檢測(cè)細(xì)胞增殖以及HBx、Bcl-2和Bax表達(dá)的變化。本研究所用的細(xì)胞株HepG2.2.15是整合了HBV DNA的人肝癌細(xì)胞，能表達(dá)較高水平的HBx[10]。Pifithrin-α能可逆性地抑制P53依賴的基因轉(zhuǎn)錄激活，如Bax，也可增高Bcl-2的表達(dá)，還能抑制P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]。

本研究顯示，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染能降低HepG2.2.15的增殖活力，使得停滯在G1期的細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，說明XPD能抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，與筆者既往研究結(jié)果一致[7]。而XPD抑制生長(zhǎng)的作用能被Pifithrin-α阻斷，即XPD抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用是通過P53途徑實(shí)現(xiàn)的。這證實(shí)，不僅XPD參與了P53誘導(dǎo)的凋亡過程[9]，反過來，P53也參與了XPD誘導(dǎo)的凋亡過程，XPD與P53之間能相互調(diào)節(jié)。

本研究證實(shí)了XPD可下調(diào)HBx和Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)。Bax和Bcl-2同屬于Bcl-2基因家族，但前者是抑癌基因，后者是公認(rèn)的癌基因。P53可直接下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，激活Bax的表達(dá)[12]。在本研究中，XPD能下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，這進(jìn)一步證實(shí)了XPD的抑癌作用。HBx蛋白是乙型肝炎病毒HBV合成的蛋白質(zhì),而且是HBV致肝癌的重要因素之一[13]。HBx能通過P53使得XPD表達(dá)下調(diào)[3]。而本研究顯示，XPD也能下調(diào)HBx的表達(dá)，即XPD與HBx之間亦能相互調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，XPD下調(diào)HBx和Bcl-2表達(dá)以及上調(diào)Bax表達(dá)的作用能被Pifithrin-α阻斷，表明XPD影響上述基因的表達(dá)是通過P53途徑實(shí)現(xiàn)的。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，Pifithrin-α不僅能下調(diào)Bax的表達(dá)及上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，而且能上調(diào)HBx的表達(dá)。而已有研究表明，HBx可抑制P53的活性或使其突變[14]。這表明P53與HBx之間亦能相互調(diào)節(jié)。

綜上所述，XPD是通過P53途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖的；XPD能通過P53途徑下調(diào)HBx和Bcl-2的表達(dá)以及上調(diào)Bax的表達(dá)；XPD、P53和HBx三者之間能相互作用、相互影響，共同調(diào)節(jié)肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

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