徐仟,孫振榮,李桂林,孫異臨,楊少華,,袁芳
顳葉內(nèi)側(cè)癲癇(mesial temporal lobe epilepsy,MTLE)是頑固性癲癇中最常見的類型,發(fā)作起源于顳葉內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu),主要病理改變是海馬硬化,表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增生和神經(jīng)元顯著丟失;切除硬化海馬是臨床控制癲癇發(fā)作的有效方法。MTLE特殊的病理變化促進(jìn)人們開始關(guān)注星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)病中的作用。
星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中數(shù)量最多的神經(jīng)細(xì)胞,在維持腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。已有的研究表明,神經(jīng)元的興奮性與細(xì)胞外間隙及K+濃度變化密切相關(guān)。近年來的研究已證實,水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)和內(nèi)向整流性鉀離子通道(inwardly rectifying potassium channel,Kir4.1)在星形膠質(zhì)細(xì)胞血管周圍足突(perivascular astrocyte end-feet,pAST-ef)上呈現(xiàn)極性分布,兩者不僅在結(jié)構(gòu)上共表達(dá)[1-2],而且在功能上相耦聯(lián)[3-4]:AQP4介導(dǎo)水分子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的同時,伴隨著Kir4.1對細(xì)胞外K+緩沖作用,共同維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[5]。Amiry-Moghaddam等發(fā)現(xiàn),敲除α-syntrophin基因的小鼠驚厥易感性增加,同時海馬區(qū)域pAST-ef存在AQP4顯著缺失和Kir4.1部分缺失,細(xì)胞外K+清除時間延長,提示AQP4和Kir4.1極性分布改變可能參與癲癇的發(fā)生[6]。本實驗擬應(yīng)用手術(shù)切除MTLE海馬組織,運用免疫熒光染色技術(shù)觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4和Kir4.1的分布情況,為探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在顳葉內(nèi)側(cè)癲癇發(fā)生中的作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
1.1 實驗試劑和實驗器材 膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(glial fibrillary acidic protein,GFAP): DAKO,Z0334;AQP4抗體:ABCAM,ab46182;Kir4.1抗體:ABCAM,ab80959;山羊抗兔熒光二抗:中杉金橋,IgG/Dylight594,紅色;山羊抗兔熒光二抗:中杉金橋,F(xiàn)ITC,綠色;DIPA封片劑:中杉金橋,ZLI-9057;光學(xué)顯微鏡:OLYMPUS,SZX-MVX10;透射電子顯微鏡:HITACHI,H-7650;倒置相差熒光顯微鏡:NIKON,Eclipse E600)。
1.2 實驗材料 收集2009年9月~2011年4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科16例行海馬切除術(shù)治療癲癇患者的海馬組織。切除海馬組織離體后,即刻放入4%多聚甲醛及2.5%戊二醛中固定,分別進(jìn)行后續(xù)處理。
1.3 實驗方法
1.3.1 分組 海馬組織經(jīng)常規(guī)固定、包埋、切片(片厚4μm)及HE染色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察。依據(jù)病理學(xué)改變將海馬組織分為病例組(MTLE)和對照組(非顳葉內(nèi)側(cè)癲癇,non-mesial temporal lobe epilepsy,non-MTLE)。MTLE海馬硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)為海馬組織神經(jīng)元丟失>50%及大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[7],共10例;non-MTLE診斷標(biāo)準(zhǔn)為海馬組織表現(xiàn)為輕度神經(jīng)元丟失(<25%)及少量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,存在海馬結(jié)構(gòu)附近腦組織的病變[7],共6例,分別為節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤1例、皮層發(fā)育不良4例、靜脈瘤1例。詳見表1。
1.3.2 透射電鏡檢查 海馬組織2.5%戊二醛4℃固定2 h后,依次1%鋨酸固定,環(huán)氧丙烷置換,樹脂(EPON 812)包埋,1μm半薄切片定位,40 nm超薄切片醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色,在透射電鏡(H-7650)下觀察。對照組選擇4例,病例組選擇7例。
1.3.3 免疫熒光組織化學(xué)染色及圖像分析 制備4μm石蠟切片,0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)微波熱修復(fù),山羊血清封閉,分別滴加一抗GFAP(1∶400)、AQP4(1∶80)、Kir4.1(1∶20),4 ℃孵育過夜;IgG/Dylight594或FITC標(biāo)記熒光二抗(山羊抗兔1∶100)室溫孵育2 h;DIPA封片劑封片,倒置相差熒光顯微鏡觀察、拍照。陰性對照用PBS代替一抗,其余步驟相同。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件,將圖片黑白反相處理,隨機(jī)選取6個pAST-ef區(qū)域及6個等面積其他部位區(qū)域計算平均光密度值(average optical density,AOD),分別記為AOD1和AOD2,以AOD1/AOD2值表示pAST-ef部位AQP4或Kir4.1的蛋白表達(dá)水平。
表1 患者基本資料
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗,顯著性水平α=0.05。應(yīng)用Microcal Origin統(tǒng)計繪圖軟件做圖。
2.1 光鏡檢查 HE染色顯示對照組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常,星形膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生(圖1);GFAP免疫熒光染色顯示陽性細(xì)胞著色淺淡,血管周圍綠色熒光提示星形膠質(zhì)細(xì)胞足突包繞血管(圖2)。病例組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元顯著丟失,星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增生(圖1),GFAP陽性細(xì)胞著色加深,血管周圍綠色熒光著色較細(xì)胞其他部位淺淡,同時與血管壁之間間隙增大(圖2)。陰性對照未見GFAP著色。
2.2 透射電鏡檢查 對照組海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體輕度腫脹;神經(jīng)元核膜輕度凹陷,線粒體輕度腫脹;血管形態(tài)正常(圖3)。病例組海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體及血管周圍足突均高度腫脹;神經(jīng)元核膜皺縮,核內(nèi)染色質(zhì)聚集,線粒體高度腫脹;血管受壓,管腔狹長,內(nèi)皮細(xì)胞不同程度增生(圖3)。
2.3 免疫熒光組織化學(xué)染色 對照組中AQP4主要分布于pAST-ef,其他部位沒有分布;病例組中AQP4在pAST-ef分布減少,而其他部位分布明顯增加(圖4)。Kir4.1的分布及變化與AQP4相似(圖4)。陰性對照均未見AQP4及Kir4.1著色。圖像分析顯示,pAST-ef部位AQP4蛋白表達(dá)量在對照組及病例組分別為(27.69±5.42)及(2.93±0.48)(P<0.05);Kir4.1蛋白表達(dá)量分別為(39.33±5.18)及(13.77±2.72)(P<0.05)。
人MTLE特殊的病理改變?yōu)檠芯啃切文z質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)病中的作用提供了一個很好的模型。本研究發(fā)現(xiàn),MTLE患者硬化海馬區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增生伴高度腫脹,星形膠質(zhì)細(xì)胞上AQP4和Kir4.1發(fā)生再分布,提示兩者極性分布的改變參與了MTLE的病理過程。
AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布最廣泛的水通道蛋白,特異地在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá),起著跨膜轉(zhuǎn)運水分子的作用[8]。生理狀態(tài)下,AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上呈極性分布,主要分布在pAST-ef,細(xì)胞外間隙水分子通過星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運到血管,以維持細(xì)胞內(nèi)外水分代謝平衡[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn),MTLE患者硬化海馬區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹,AQP4極性分布發(fā)生改變,在pAST-ef顯著減少,而其他部位分布增加,說明AQP4功能障礙導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹。Eid等也報道,與non-MTLE相比,MTLE患者硬化海馬pAST-ef處AQP4分布減少44%左右[11]。我們推測,AQP4的再分布影響了星形膠質(zhì)細(xì)胞對水平衡的調(diào)節(jié)作用,水分子滯留于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞腫脹,細(xì)胞外間隙容積減少,間接引起細(xì)胞外興奮性氨基酸和K+濃度增加,提高局部腦組織的興奮性;另有研究顯示,腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過容積敏感性陰離子通道(volume-regulated anion channels,VRACs)釋放興奮性氨基酸,導(dǎo)致腦組織細(xì)胞外間隙興奮性氨基酸濃度增高,從而激活神經(jīng)元引起顳葉癲癇發(fā)生[12]。
Kir4.1亦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的膜蛋白,主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá),起著跨膜轉(zhuǎn)運K+的作用,且呈電壓依賴性[13]。星形膠質(zhì)細(xì)胞靜息膜電位取決于K+擴(kuò)散平衡電位,Kir4.1主要介導(dǎo)K+由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)運輸;當(dāng)神經(jīng)元興奮時細(xì)胞外K+濃度增加,細(xì)胞內(nèi)外電壓差增高,K+通過星形膠質(zhì)細(xì)胞上Kir4.1進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),再由pAST-ef處Kir4.1輸送到血管內(nèi),達(dá)到清除細(xì)胞外K+,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[14]。雖然在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤上觀察到pAST-ef處Kir4.1極性分布改變[15],但是在癲癇患者腦組織中Kir4.1分布變化還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn),MTLE患者硬化海馬區(qū)域Kir4.1在pAST-ef分布減少,極性分布改變,推測可能會引起星形膠質(zhì)細(xì)胞清除K+能力降低。Hinterkeuser等利用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn),MTLE患者硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上Kir4.1對于細(xì)胞外K+緩沖能力降低,細(xì)胞外間隙K+聚集[16]。而細(xì)胞外K+濃度不足微摩爾水平的升高就可以急劇增加癲癇樣活動的發(fā)生[17-18]。另外,Kuncheryavykh等采用siRNA技術(shù)敲除大鼠大腦皮層膠質(zhì)細(xì)胞的Kir4.1基因后發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)去極化狀態(tài),并且對細(xì)胞外谷氨酸攝取減少33%,使得細(xì)胞外谷氨酸濃度增加引起癲癇發(fā)生[19]。
根據(jù)以上研究結(jié)果推測,Kir4.1的再分布使K+由細(xì)胞運送到血管內(nèi)產(chǎn)生障礙,K+在細(xì)胞內(nèi)過量聚集及清除細(xì)胞外K+功能降低,細(xì)胞內(nèi)外電壓差減低,呈現(xiàn)去極化狀態(tài);Kir4.1對K+緩沖能力減弱,以及對谷氨酸攝取能力的減低,加之AQP4再分布引起的胞外容積減少,使得神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性后釋放到胞外的K+及谷氨酸異常聚集,引起局部腦組織興奮性增加,參與MTLE的發(fā)生。
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