陽(yáng)和湯對(duì)裸鼠移植性乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型作用機(jī)制的探討

田 莎，王云丹，黃立中，田雪飛，許利純，伍參榮，彭吉勇

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.長(zhǎng)沙市中醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410100）

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而骨轉(zhuǎn)移又是乳腺癌常見(jiàn)的并發(fā)癥，其臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性骨痛、骨折、功能障礙、脊索及神經(jīng)根受壓、貧血、高鈣血癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，危及生命[1-2]。黃立中教授運(yùn)用陽(yáng)和湯加味治療骨轉(zhuǎn)移癌疼痛取得較好療效[3-4]。本實(shí)驗(yàn)探討名方陽(yáng)和湯對(duì)裸鼠移植性乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型的作用，以及對(duì)模型鼠血清甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白 （PTHrP）、NF-KB 配體的受體（RANKL）、骨保護(hù)素（OPG）含量的影響，揭示陽(yáng)和湯體內(nèi)抗癌作用的分子機(jī)制，為臨床治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移提供科學(xué)的理論依據(jù)?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 BALB/c 6～8 周齡裸小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雌性，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2009-2004。

1.1.2 藥物 陽(yáng)和湯由熟地黃30 g、鹿角膠9 g、肉桂3 g、炮姜炭2 g、白芥子6 g、麻黃2 g、生甘草3 g 組成。購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，將藥物制成高劑量水煎液 （1 mL 藥液中含1.17 g 生藥）、低劑量水煎液（1 mL 藥液中含0.39 g生藥），密封備用。唑來(lái)磷酸，正大天晴藥業(yè)，規(guī)格4 mg／5 mL，批號(hào)0908272。

1.1.3 瘤株 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫(kù)。

1.1.4 試劑PTHrP ELISA kit，批號(hào)：E0900100226；RANKL ELISA kit，批號(hào) ：E0900100101；OPG ELISA kit，批號(hào)：E0900613；均購(gòu)自長(zhǎng)沙市佳和生物科技有限責(zé)任公司(美國(guó)INVITROGEN 公司生產(chǎn))。

1.1.5 儀器 超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1CV，蘇凈安泰公司；CO2培養(yǎng)箱：SHEL-LAB，美國(guó)Hitachi；酶標(biāo)儀：奧地利TECAN；臺(tái)式離心機(jī)：TDZ5-40，長(zhǎng)沙天創(chuàng)儀器公司；恒溫水浴箱：GG112-10B，上海醫(yī)療器械廠；恒溫干燥箱：101B-2，上海亞明公司；自動(dòng)酶標(biāo)儀：奧地利TECAN；37 ℃恒溫箱：GG112-10B，上海醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將成瘤后的裸鼠移植性乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型隨機(jī)分為4 組：陽(yáng)和湯高劑量組、陽(yáng)和湯低劑量組、唑來(lái)磷酸組、模型組，每組8 只。另取8 只裸鼠股骨注射生理鹽水（其他手術(shù)方法同“1.2.2”）設(shè)為假手術(shù)組。

1.2.2 動(dòng)物造模 裸鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg） 麻醉后，75%乙醇消毒裸鼠皮膚，1 mL 注射器抽取2×107個(gè)/mL 人乳腺癌細(xì)胞懸液0.08 mL（約含1.6×106個(gè)乳腺癌細(xì)胞），從股骨遠(yuǎn)端進(jìn)針，平行經(jīng)皮下，至股骨近端骨質(zhì)疏松處刺透骨皮質(zhì)，然后將針尖插入骨干內(nèi)，緩慢推注細(xì)胞懸液（0.08 mL/只），接種完成。

1.2.3 給藥方法 陽(yáng)和湯高、低劑量組：每天灌胃陽(yáng)和湯23.40 g/（kg·d）（相當(dāng)于陽(yáng)和湯臨床劑量3 倍）、7.80 g/（kg·d）（相當(dāng)于陽(yáng)和湯臨床劑量），連續(xù)給藥20 d；唑來(lái)磷酸組：取濃度為3 μg/mL 唑來(lái)膦酸稀釋液腹腔注射，按30 μg/kg。陽(yáng)和湯用藥開始日設(shè)為第1 天，第5、7、9、12、14、16、19 天，每天每只1 次[5]；模型組、假手術(shù)組：取生理鹽水0.4 mL 灌胃，每天每只1 次，連續(xù)給藥20 d。給藥劑量均按60 kg 成年人體表面積換算。

1.2.4 腫瘤大小 造模術(shù)后第5、10、15、20、25 天用游標(biāo)卡尺體外測(cè)量骨轉(zhuǎn)移癌灶的長(zhǎng)徑 （a） 及短徑（b），按公式V（mm3）=ab2π/6 計(jì)算骨轉(zhuǎn)移癌的體積。根據(jù)腫瘤體積的變化繪制各組的骨轉(zhuǎn)移癌生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 抑瘤率 公式：抑瘤率=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%，計(jì)算腫瘤的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定 采用ELISA 法檢測(cè)各組裸鼠血清中相關(guān)調(diào)節(jié)因子PTHrP、RANKL、OPG 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型的復(fù)制

股骨接種人乳腺癌細(xì)胞5 d 后32 只裸鼠股骨接種處陸續(xù)出現(xiàn)可觸及的結(jié)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，種瘤處組織的HE 染色切片置于光鏡下觀察，均發(fā)現(xiàn)骨組織完全破壞，被癌組織代替。證實(shí)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型復(fù)制成功（見(jiàn)圖1）。

圖1 接種乳腺癌細(xì)胞25 d 后，裸鼠接種處組織形態(tài)（HE 染色×200）

2.2 陽(yáng)和湯對(duì)各組裸鼠骨轉(zhuǎn)移癌生長(zhǎng)的影響

根據(jù)各組裸鼠骨轉(zhuǎn)移癌的生長(zhǎng)情況繪制生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖2），與模型組比，給藥各組對(duì)骨轉(zhuǎn)移癌生長(zhǎng)均產(chǎn)生不同程度的抑制作用。其中陽(yáng)和湯高劑量組和唑來(lái)磷酸組骨轉(zhuǎn)移癌生長(zhǎng)緩慢，抑制作用優(yōu)于陽(yáng)和湯低劑量組。

圖2 各組裸鼠骨轉(zhuǎn)移癌生長(zhǎng)曲線

2.3 陽(yáng)和湯對(duì)各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤抑瘤率的影響

結(jié)果顯示唑來(lái)磷酸組、陽(yáng)和湯高、低劑量組的骨轉(zhuǎn)移癌抑制率分別為50.61%、45.05%、32.42%。陽(yáng)和湯高、低劑量組、唑來(lái)磷酸組的骨轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)和湯對(duì)各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量的影響（±s，n=8）

表1 陽(yáng)和湯對(duì)各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤質(zhì)量的影響（±s，n=8）

注：與模型組比較△P＜0.05；與唑來(lái)磷酸組比較▲P＜0.05；與陽(yáng)和湯高劑量組比較*P＜0.05。

組 別模型租唑來(lái)膦酸組陽(yáng)和湯高劑量組陽(yáng)和湯低劑量組藥物劑量（g/kg）—0.30×10-4 23.40 7.80瘤重(g)0.808±0.120 0.399±0.089△0.444±0.053△▲0.546±0.098△▲*抑瘤率（%）—50.61 45.05 32.42

2.4 陽(yáng)和湯對(duì)裸鼠移植人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移血清PTHrP、RANKL、OPG、RANKL/OPG 的影響

根據(jù)各組PTHrP、RANKL、OPG 的濃度方差齊性的比較，用LSD 法進(jìn)行組間比較，陽(yáng)和湯高劑量組PTHrP 含量明顯低于模型組（P＜0.05），與假手術(shù)組、唑來(lái)磷酸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陽(yáng)和湯高劑量組對(duì)RANKL 的增殖抑制作用，其含量明顯低于模型組，高于假手術(shù)組、唑來(lái)膦酸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；陽(yáng)和湯高劑量組OPG 含量明顯高于模型組，低于假手術(shù)組、唑來(lái)膦酸組以及低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽(yáng)和湯高劑量組隊(duì)對(duì)RANKL/OPG 比值的影響，明顯高于模型組，低于假手術(shù)組、唑來(lái)磷酸組以及低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移屬中醫(yī)“骨蝕”、“骨瘤”、“骨痹”、“骨疽”等范疇，骨轉(zhuǎn)移癌局部腫塊堅(jiān)硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不變、面色晦暗等臨床特征，與“陰盛則寒、寒主收引、主凝滯、主痛”等中醫(yī)理論相符，屬陰寒證。推測(cè)陽(yáng)虛可能是乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的促發(fā)因素。則可以通過(guò)溫陽(yáng)散寒的方法防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。

陽(yáng)和湯出自清·王洪緒的《外科證治全生集》[6]，是溫陽(yáng)散寒代表方。陽(yáng)和湯方中重用熟地、鹿角膠為君，輔以炮姜炭、肉桂為臣，以麻黃、白芥子為佐，甘草為使藥。全方共奏溫陽(yáng)補(bǔ)腎、散寒通滯之功。這是溫陽(yáng)養(yǎng)血散寒通滯的陽(yáng)和湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的理論依據(jù)。前期實(shí)驗(yàn)研究證明溫陽(yáng)散寒治法有一定抗癌、鎮(zhèn)痛、提高腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能[7]。長(zhǎng)期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者多有陽(yáng)氣不足、寒凝瘀滯狀態(tài)，化療后患者尤其明顯，驗(yàn)之以溫陽(yáng)散寒通滯的陽(yáng)和湯制劑，確對(duì)乳腺骨轉(zhuǎn)移癌有顯著療效[8]。文獻(xiàn)報(bào)道用陽(yáng)和湯治療骨腫瘤，多數(shù)骨轉(zhuǎn)移癌患者疼痛減輕，服藥期間原有病灶未見(jiàn)擴(kuò)大及轉(zhuǎn)移[9]。

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型是研究人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制及其治療措施的重要工具。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，自發(fā)性的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移現(xiàn)象很少發(fā)生。目前，移植性乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型復(fù)制方法有三：①局部注射法；②乳腺癌的原位種植；③血流播散法。采用骨組織局部注射法復(fù)制骨轉(zhuǎn)移模型，這種方法簡(jiǎn)便易行，不受多臟器轉(zhuǎn)移的影響。造模成功率高，模型結(jié)果也與臨床上所見(jiàn)的骨轉(zhuǎn)移狀況相類似[10-11]。

表2 陽(yáng)和湯對(duì)各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移血清PTHrP、RANKL、OPG、RANKL/OPG 的影響 （±s，n=8）

表2 陽(yáng)和湯對(duì)各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移血清PTHrP、RANKL、OPG、RANKL/OPG 的影響 （±s，n=8）

注：與假手術(shù)組比較＊P＜0.05；與模型組比較△P＜0.05；與唑來(lái)磷酸組比較▲P＜0.05；與陽(yáng)和湯高劑量組比較＃P＜0.05。

組 別假手術(shù)組模型組唑來(lái)膦酸組陽(yáng)和湯高劑量組陽(yáng)和湯低劑量組藥物劑量（g/kg）— —0.30×10-4 23.40 7.80 PTHrP(ng/mL)44.72±6.26 86.54±15.58＊64.14±8.95＊△52.30±5.77△73.15±6.99＊＃RANKL(pg/mL)188.54±19.78 388.80±86.20＊244.78±23.73＊△331.59±47.81＊▲297.30±30.67＊▲OPG(pg/mL)289.85±39.76 95.65±10.40＊202.31±12.74＊△149.39±22.73＊△▲124.37±7.61＊△▲RANKL/OPG 0.66±0.13 4.07±0.85＊1.21±0.12＊△2.27±0.51＊△▲2.39±0.22＊△▲

正常的骨代謝是通過(guò)成骨細(xì)胞的成骨作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而保持一種動(dòng)態(tài)平衡[12]。在這個(gè)過(guò)程中，大量的相關(guān)因子參與其中，成為骨微環(huán)境主要部分。乳腺癌以溶骨性轉(zhuǎn)移為主，它以骨組織的破壞吸收為特點(diǎn)，是破骨細(xì)胞直接作用的結(jié)果[13]。乳腺癌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨基質(zhì)細(xì)胞共同參與這一過(guò)程。這些細(xì)胞分泌的相關(guān)因子在骨轉(zhuǎn)移發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。其中，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的PTHrP 是主要的破骨細(xì)胞激活因子[14]。在腫瘤骨轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，起到正性調(diào)節(jié)作用[15]。PTHrP 刺激成骨細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞合成RANKL，通過(guò)未成熟破骨細(xì)胞表面的RANK 信號(hào)系統(tǒng)，RANKL 刺激轉(zhuǎn)錄因子起始轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致未成熟的破骨細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞[16]；并且同時(shí)抑制OPG 的合成。OPG 是RANKL 的無(wú)功能受體，它能與破骨細(xì)胞表面的RANK 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，在體內(nèi)、體外情況下均能抑制破骨細(xì)胞成熟和活化。目前認(rèn)為RANKL/OPG 的比例是破骨細(xì)胞活性的決定因素之一[17-18]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間失去平衡，促進(jìn)骨吸收作用。其主要作用機(jī)制為：骨溶解——釋放生長(zhǎng)因子——刺激腫瘤細(xì)胞增殖——PTHrP 等破骨細(xì)胞激活因子——通過(guò)RANKL／RANK 激活破骨細(xì)胞——骨溶解，形成惡性循環(huán)導(dǎo)致溶骨性轉(zhuǎn)移的不斷演進(jìn)[13]。

在骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中，OPG 的表達(dá)量會(huì)很低，PTHrP和RANKL 的表達(dá)量增加，這樣就促使骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而當(dāng)促進(jìn)或抑制相關(guān)調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生時(shí)，就能夠在一定程度上抑制骨的轉(zhuǎn)移。通過(guò)ELISA 法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)和湯高、低劑量均對(duì)相關(guān)調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生了調(diào)控作用：促進(jìn)OPG 的表達(dá)，抑制PTHrP、RANKL的表達(dá)。其中尤以陽(yáng)和湯高劑量應(yīng)用效果最為明顯。因此陽(yáng)和湯抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制值得我們更深入研究。

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