HPLC同時測定菟絲子不同炮制品中5種主要活性成分含量

肖 嵐，楊梓懿，石繼連

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

菟絲子為旋花科植物菟絲子（Cμscμta chinensis Lam）的干燥成熟種子，具有滋補肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉的功效，臨床上用于陽痿遺精、尿有余瀝、遺尿尿頻、腰膝酸軟、目昏耳鳴、腎虛胎漏、胎動不安、脾腎虛瀉、白癜風(fēng)等癥[1]。菟絲子質(zhì)地堅硬，不易粉碎，有效成分難于溶出，歷代菟絲子炮制方法多樣，常用的有清炒、鹽炙、酒炙、制餅等。黃酮類是菟絲子中研究較多且具特征性的成分，其中的槲皮素、金絲桃苷等具有多種藥理活性，菟絲子總黃酮具有改善實驗性心肌缺血、調(diào)節(jié)機體免疫、刺激內(nèi)分泌等多種功能[2-4]。楊青月等采用HPLC 比較了菟絲子三種炮制品中3 種黃酮類成分，考察范圍并不全面，有效成分檢出含量低[5]。本研究采用高效液相色譜法，建立了5 種主要藥效成分綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素含量分析方法，并對菟絲子生品、酒炙品、鹽炙品、清炒品、菟絲子餅進(jìn)行了含量測定。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀，配G1329A 自動控溫進(jìn)樣器及G1314B 可變波長檢測器 （Agilent 公司）；色譜柱為Kromasil ODS-1 柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；ΜV- 265 型分光光度計(日本島津)；FZ102 微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Item AR1140 分析天平和Item AR5120 電子天平 （Ohaμs Corp.Pine Brook.NJ.ΜSA）。

綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號分別為 110753 -200413、111521 -201004、100080-20090、110861-200606、10860-200407)，黃酒( 湖南湘窖酒業(yè)有限公司，批號：XK16-0300934)，加碘精制鹽(市售)，甲醇為色譜純；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

菟絲子（湖南海川醫(yī)藥有限公司）經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室周日寶教授鑒定為旋花科植物菟絲子Cμscμta chinensis Lam.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 菟絲子炮制品的制備[6-7]

2.1.1 生菟絲子 取原藥材，除去雜質(zhì)，淘洗干凈，干燥，密閉保存，備用。

2.1.2 清炒菟絲子 取凈菟絲子，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至微黃色，有爆裂聲，取出放涼，密閉備用。

2.1.3 鹽炙菟絲子 取凈菟絲子，加鹽水拌勻，悶潤，待鹽水被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至略鼓起，微有爆裂聲，并有香氣溢出時，取出放涼，密閉備用。每100 g 菟絲子用食鹽2 g。

2.1.4 酒炙菟絲子 用黃酒代替鹽水按“2.1.3”項下方法操作即得。每100 g 菟絲子用黃酒20 mL。

2.1.5 酒菟絲子餅 取凈菟絲子，加適量水煮至開裂，不斷攪拌，待水被吸盡后，全部呈黏絲稠粥狀時，加入黃酒和白面拌勻，取出，壓成餅，切成小方塊，干燥，密閉備用。每100 g 菟絲子加黃酒15 g，白面粉15 g。

2.2 供試品溶液制備

分別稱取上述菟絲子不同炮制品適量，用粉碎機粉碎（過20 目篩），取粗粉各約5 g 精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱質(zhì)量，超聲（50 V）30 min 后稱質(zhì)量，補足減失的質(zhì)量，離心，取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

Kromasil ODS-1 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～10 min，25% A；10～15 min，25%～45%A；15～20 min，45%～65% A；20～27 min，65%～70%A。流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL。按照上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，各待測組分峰與其相鄰峰均能達(dá)到基線分離，保留時間在27 min 內(nèi)，對照品與代表樣品（清炒品）的色譜圖見圖1。

圖1 綠原酸等5 種對照品與菟絲子樣品的HPLC 圖

2.4 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品綠原酸2.8 mg、金絲桃苷5.0 mg、槲皮素5.0 mg、山柰酚5.4mg、異鼠李素5.5 mg，加甲醇溶解，配成每毫升含綠原酸140.0 μg、金絲桃苷350.0 μg、槲皮素25.0 μg、山柰酚43.2 μg、異鼠李素5.5 μg 的混合對照品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液3、5、7、9、12、15 μL依次進(jìn)樣，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程和線性范圍見表1。

表1 回歸方程和線性范圍

2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，在“2.3”項下條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，分別計算峰面積的RSD為：綠原酸0.4%，金絲桃苷 0.2%，槲皮素1.2%，山柰酚1.5%，異鼠李素1.3%。表明儀器的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一菟絲子炮制品 （清炒品） 粉末6份，每份2 g，按“2.2”項下操作制備供試品溶液，按“2.3”項下條件測定，記錄各色譜峰峰面積。分別計算綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的平均含量（RSD）分別為5.74%（1.9%），10.09%（1.6%），0.66%（1.5%），1.25%（1.8%），0.13%（1.9%）。表明本方法測定重復(fù)性較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密吸取菟絲子炮制品（清炒品）供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，分別在0、1、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，測定菟絲子炒制品中5 種被測成分的峰面積，計算RSD，結(jié)果8 h 時綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素峰面積的RSD 分別為0.5%，0.2%，1.2%，0.5%，1.9%。表明在8 h 內(nèi)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的菟絲子炮制品（清炒品）粉末6 份，每份2.5 g，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，按“2.2”項下方法操作制備供試品溶液。每份準(zhǔn)確加入混合對照品溶液2 mL，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 菟絲子炮制品（清炒品）粉末加樣回收率 （μg）

2.10 樣品含量測定

精密稱取菟絲子不同炮制品粉末各3 份，每份5.0 g，按“2.2” 項下方法操作制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算菟絲子不同炮制品中綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 流動相的選擇

表3 菟絲子不同炮制品中5 種主要成分含量測定 （±s，n=3，%）

表3 菟絲子不同炮制品中5 種主要成分含量測定 （±s，n=3，%）

炮制品生品菟絲子清炒菟絲子鹽炙菟絲子酒制菟絲子菟絲子餅綠原酸4.57±0.01 5.77±0.03 5.13±0.06 5.57±0.01 3.87±0.02金絲桃苷7.57±0.03 10.08±0.05 9.46±0.04 10.43±0.06 8.79±0.04槲皮素0.291±0.001 0.672±0.003 0.622±0.002 0.591±0.001 0.294+0.003山柰酚1.23±0.01 1.24±0.01 1.52±0.01 0.92±0.02 0.70±0.01異鼠李素0.100±0.001 0.117±0.001 0.157±0.002 0.187±0.002 0.089±0.001

本實驗曾選用甲醇-0.4%磷酸水溶液進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果表明采用等度洗脫，色譜峰達(dá)不到分離要求，選擇甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脫，出峰時間短，無其他成分的干擾，在本色譜條件下綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品保留時間分別為9.1、20.1、22.8、24.5、25.1 min。在本色譜條件下得到的色譜峰形和分離度均好。

3.2 檢測波長的選擇

分別取綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品溶液在300～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果在360、367 nm 處均有較大吸收，360 nm 處吸收值更大，干擾最少，故選360 nm 作為檢測波長。

3.3 不同炮制品各成分含量的差異

根據(jù)測定結(jié)果可知，不同菟絲子炮制品中綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量有較大差異。清炒品中綠原酸含量比生品增加26.3%，比鹽炙品增加12.5%。綠原酸為縮酚酸，本身不穩(wěn)定，易分解。炒制是利用短時間快速加熱的方式進(jìn)行，使得綠原酸相對穩(wěn)定，在熱水或醇溶液中的溶解度增大。炒制品中槲皮素含量最高，可能與菟絲子中金絲桃苷、蘆丁等黃酮苷類物質(zhì)受熱發(fā)生分解，增加了槲皮素的溶出有關(guān)。與酒炙品相比較鹽炙品中山柰酚含量增加，但金絲桃苷含量降低，可能是由于用鹽水潤制過程中，鹽水滲透到藥材內(nèi)部，有助于水、醇溶性物質(zhì)的溶出，但對于黃酮苷類的溶出不利。酒炙品中金絲桃苷和異鼠李素的含量最高，分別是10.43%和0.187%。酒炙后金絲桃苷溶出增加得最多，這對于解釋酒炙增強溫腎壯陽的作用具有一定意義，但是酒炙品中黃酮類成分為何略高于鹽炙品還需進(jìn)一步研究。

菟絲子生品質(zhì)地堅硬，不易粉碎，有效成分較難溶出。本實驗采取短時間高溫加熱的方式進(jìn)行炮制加工，結(jié)果有利于菟絲子有效成分的溶出，提示臨床上菟絲子宜用炮制品不宜用生品。清炒法、鹽炙法、酒炙法均可明顯增加有效成分溶出，酒炙菟絲子餅工藝繁雜，對有效成分溶出影響不明顯，現(xiàn)代應(yīng)用并不廣。黃酮類是菟絲子中研究較多且具特征性的成分，與菟絲子的補肝腎功能有密切關(guān)系，其中的槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、綠原酸、異鼠李素等具有多種藥理活性，不同炮制方法對其含量變化有影響，炮制作用機制仍需進(jìn)一步研究。本實驗可為制定菟絲子飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)臨床用藥規(guī)范提供實驗依據(jù)。

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