密蒙花方對(duì)缺氧狀態(tài)下人血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

吳正正 嚴(yán) 京 高健生 接傳紅 陳皆春

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetes retinopathy，DR）是糖尿病常見及嚴(yán)重并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量，目前有關(guān)DR的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，各種治療方法尚不理想。從中醫(yī)藥中尋求有效防治DR的藥物及方法是目前的研究熱點(diǎn)。本研究所采用的密蒙花方，是導(dǎo)師高健生研究員多年臨證總結(jié)的有效防治DR的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究已證實(shí)其具有抑制細(xì)胞增殖的作用〔1〕，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步從密蒙花方對(duì)缺氧狀態(tài)下人血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響來探討其抑制細(xì)胞增殖、阻止新生血管發(fā)生的具體作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：RPMⅠ1640培養(yǎng)基干粉購自美國GⅠBCO公司；二氯化鈷、胰蛋白酶購自SⅠGMA公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。雙抗為南京凱基科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞來源：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vascular endothelial cell，HUVEC）株購自南京凱基科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 中藥來源：購自北京燕北藥材公司，經(jīng)我院藥房鑒定為道地藥材。生黃芪（產(chǎn)于內(nèi)蒙古），女貞子、益母草（產(chǎn)于河北），黃連（產(chǎn)于四川），肉桂（產(chǎn)于廣東），密蒙花（產(chǎn)于湖北）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（NAPCO公司），超凈工作臺(tái)（北京月壇儀器廠），倒置相差顯微鏡（奧林巴斯），流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)：取HUVEC細(xì)胞株，采用胰蛋白酶（0.25%）消化法在 37℃下5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿融合后按1∶3分瓶傳代。

1.2.2 密蒙花方水提液制備：密蒙花方所含中藥材沸水浴煎30 min，過濾并收集濾液，取濾渣重復(fù)提取1次，合并2次濾液。加入2倍體積90%乙醇4℃過夜，離心去除乙醇不溶成分。定容至濃度為1 g/ml水提液。微孔濾膜濾過滅菌。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：每組設(shè)6個(gè)平行樣本。①空白組：RPMⅠ1640維持液；②缺氧組：空白組 ＋終濃度100 μmol/L CoCl2；③密蒙花方低濃度組：缺氧組＋10 mg/ml密蒙花方水提液；④密蒙花方中濃度組：缺氧組＋20 mg/ml密蒙花方水提液；⑤密蒙花方高濃度組：缺氧組＋40 mg/ml密蒙花方水提液。

1.2.4 流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）檢測密蒙花方對(duì)HUVEC細(xì)胞周期的影響：①將細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分組將CoCl2和不同濃度的密蒙花方水提液分別與HUVEC共同孵育24 h后消化收集細(xì)胞。②將預(yù)冷的70%乙醇沿壁緣滴入，輕輕吹打細(xì)胞，4℃固定12 h以上。③離心（1 000 r/min，4 min），PBS 洗 2 次，棄上清。 ④加入濃度為 1 mg/ml RNaseA 30 μl，37℃恒溫水浴鍋中孵育30 min。 ⑤加入碘化丙啶（propidium iodine，PⅠ）染色液800 μl，4℃避光30 min。⑥FCM測定DNA含量，所有資料經(jīng)軟件Modfit 3.0分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的HUVEC形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見，HUVEC貼壁生長，呈鋪路石狀鑲嵌排列。細(xì)胞為扁平多角形，胞質(zhì)透明，胞漿豐富，胞體肥大，胞膜清晰。細(xì)胞核為圓形或橢圓形。傳代培養(yǎng)時(shí)約30 min開始貼壁生長。剛貼壁的細(xì)胞呈圓形，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切位蛩笮危?xì)胞間相互連接。約2～3 d后，細(xì)胞可長滿融合，呈緊密排列的單層上皮細(xì)胞。缺氧組鏡下觀察：細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下較正常細(xì)胞增殖旺盛。密蒙花方組鏡下觀察：細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞間隙增大，部分區(qū)域脫落，可見部分死細(xì)胞（圖1）。

2.2 FCM檢測密蒙花方對(duì)HUVEC細(xì)胞周期的影響

與正常組比較，缺氧組G0/G1期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例增高（P＜0.01），說明缺氧狀態(tài)下HUVEC增殖旺盛。與缺氧組比較，各密蒙花方組均表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例減少（P＜0.01），說明密蒙花方使缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞阻滯于G0/G1期，具有抑制HUVEC增殖的作用。隨密蒙花方濃度的增高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增高，S期細(xì)胞比例則逐漸下降（P＜0.01），具有量效關(guān)系。其中40 mg/ml密蒙花方作用最顯著（表1，圖2）。

經(jīng)FCM檢測，提示密蒙花方具有阻止HUVEC由G1期進(jìn)入S期，從而抑制缺氧狀態(tài)下HUVEC增殖的作用。另外在密蒙花方作用24 h后，還出現(xiàn)了指示細(xì)胞凋亡的亞G1期凋亡峰，說明密蒙花方對(duì)缺氧狀態(tài)下HUVEC具有促凋亡作用。

表1 FCM檢測各組HUVEC細(xì)胞周期構(gòu)成比較（±s，%）（每組樣本數(shù)=6）

表1 FCM檢測各組HUVEC細(xì)胞周期構(gòu)成比較（±s，%）（每組樣本數(shù)=6）

注：FCM：流式細(xì)胞儀。①缺氧組與正常組比較，P＜0.01；②各密蒙花方組分別與缺氧組比較，P＜0.01；③密蒙花方中濃度與低濃度比較，P＜0.01；④密蒙花方高濃度與中濃度比較，P＜0.01。

G0/G1期 S期 G2/M期正常組 57.928±1.226 33.015±2.352 8.03±0.764缺氧組 46.165±2.748① 48.085±3.171① 7.12±0.810密蒙花方低濃度組 54.220±1.627② 32.437±1.181② 10.034±0.069密蒙花方中濃度組 59.872±2.226②③ 29.552±1.892②③ 10.212±0.165密蒙花方高濃度組 67.313±1.692②④ 26.757±1.365②④ 6.901±0.441

3 討論

密蒙花方是在密蒙花，交泰丸（黃連、肉桂）的基礎(chǔ)上加黃芪，女貞子等藥組成。黃芪大補(bǔ)元?dú)?，女貞子補(bǔ)肝腎明目，黃連，肉桂相配使水火既濟(jì)，能安神寧血，密蒙花清肝火除翳膜，可入血絡(luò)退赤脈，諸藥相配伍，共奏益氣滋陰，和血明目的功效，臨床上治療DR的效果顯著〔2〕。本課題從細(xì)胞分子水平探討密蒙花方對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，為臨床實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

在DR的病理過程中，新生血管形成是DR進(jìn)入增殖期的標(biāo)志。新生血管的發(fā)生發(fā)展是目前臨床上面臨的難題。如果能夠在某種程度上抑制新生血管的形成，將對(duì)于防治DR具有重要意義。

FCM是一種快速的單細(xì)胞定量分析方法，它利用分光光度法的原理，定量分析細(xì)胞的各種生物化學(xué)成分。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)最終發(fā)生在細(xì)胞周期水平上。細(xì)胞周期按時(shí)相順序依次進(jìn)展至G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（有絲分裂前期）和M期（有絲分裂期），最終出現(xiàn)細(xì)胞增殖。通過觀察細(xì)胞周期變化，有助于深入了解藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

正常增殖細(xì)胞存在不同DNA的含量，隨各時(shí)相呈現(xiàn)出周期性變化：在G1期，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA的含量仍保持二倍體；進(jìn)入S期后，DNA開始合成，這時(shí)細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1和G2之間；當(dāng)復(fù)制結(jié)束成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G2期，G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。單純從DNA含量無法區(qū)分G2期和M期；一旦細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞，這兩個(gè)子細(xì)胞或者進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0），而G0期從DNA含量上同樣無法與G1期區(qū)分。因此整個(gè)復(fù)制周期可以描繪為G0/G1期、S期、G2/M期。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由FCM進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出各期細(xì)胞的比例，以了解細(xì)胞的增殖能力。通常以S期細(xì)胞比率作為判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。細(xì)胞周期進(jìn)程中有兩個(gè)限制點(diǎn)，分別在G1/S轉(zhuǎn)變期和G2/M轉(zhuǎn)變期，也即在細(xì)胞增殖周期中存在許多稱作關(guān)卡（check-point）的監(jiān)控系統(tǒng)，當(dāng)它探測到基因組或紡錘體損傷時(shí)，就會(huì)剎住細(xì)胞周期進(jìn)展，使細(xì)胞停留在G1/S或G2/M轉(zhuǎn)變期，允許細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)，以維持遺傳穩(wěn)定性〔3〕。

本實(shí)驗(yàn)中密蒙花方低、中、高濃度是通過CCK-8法來確定的，三種濃度均可排除對(duì)細(xì)胞的毒性作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常組比較，缺氧組HUVEC G0/G1期細(xì)胞百分率下降，S期細(xì)胞百分率升高，說明缺氧組HUVEC增殖旺盛。10、20、40 mg/ml的密蒙花方分別作用于缺氧狀態(tài)下HUVEC 24 h后，與缺氧組比較，G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低，表明密蒙花方使缺氧狀態(tài)下的HUVEC阻滯于G1/S轉(zhuǎn)變期，從而抑制了細(xì)胞增殖。另外，密蒙花方作用于HUVEC 24 h后還出現(xiàn)了指示細(xì)胞凋亡的亞G1期凋亡峰，提示密蒙花方對(duì)缺氧狀態(tài)下的HUVEC有促凋亡作用。

本研究細(xì)胞周期分析揭示了密蒙花方對(duì)缺氧狀態(tài)下HUVEC細(xì)胞增殖的影響在于：（1）阻止細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，且隨密蒙花方劑量提高，該作用越明顯；（2）密蒙花方還具有促進(jìn)缺氧狀態(tài)下HUVEC凋亡的作用。這對(duì)于抑制視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生，防治DR具有積極的意義。由于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化受復(fù)雜的分子基因調(diào)控，詳細(xì)的調(diào)控機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

[1]吳正正，高健生，接傳紅，等.密蒙花方對(duì)缺氧狀態(tài)下人血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)理研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2008，18（3）：138-140.

[2]高健生，接傳紅，羅旭昇，等.交泰丸合密蒙花辨證治療早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的新思路[J].世界中醫(yī)藥，2007，5（3）：143-144.

[3]王金發(fā).細(xì)胞生物學(xué)[M].科學(xué)出版社，2003：508-511.