基于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA的序列特異性擴(kuò)增標(biāo)記法對(duì)烏蘇里貉食毛癥的分析

魏 來，付 晶，楊春山，白秀娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

貉（Nyctereutes）在動(dòng)物分類上屬食肉目（Carnivora），犬科（Canidae），貉屬（Nyctereutesgenus），別名貉子，是珍貴的毛皮動(dòng)物。其皮是制做皮大衣、皮領(lǐng)、皮帽的高級(jí)原料。食毛癥是籠養(yǎng)貉的常見病，該病導(dǎo)致貉被毛粗亂，輕者造成針毛、底絨參差不齊，尾根裸露；嚴(yán)重者皮膚外露，甚至出血、潰瘍，給飼養(yǎng)戶造成經(jīng)濟(jì)損失。然而該病的發(fā)病機(jī)理和影響因素尚不明確，彭毛［1］認(rèn)為食毛癥是由于日飼喂料中缺乏含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨基酸），F(xiàn)rank M D［2］等認(rèn)為，鐵元素的缺乏會(huì)引起食毛癥的發(fā)生。也有學(xué)者認(rèn)為，周圍環(huán)境和氣候的驟然變化會(huì)引起食毛癥的 發(fā) 生［3］。本試驗(yàn)以 SCAR（sequnence－character amplified regions）標(biāo)記對(duì)貉子食毛癥遺傳學(xué)病因進(jìn)行探討，為開展貉子抗病育種的標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。李玉梅［4］、馬麗娜［5］、劉宗岳［6］等將該方法也被應(yīng)用于水貂自咬癥的檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 黑龍江省大慶市泰安貉養(yǎng)殖基地提供飼養(yǎng)條件和遺傳背景均一致的烏蘇里貉87只，健康貉子56只，患食毛癥貉子31只，－20℃冷凍保存。

1.2 隨機(jī)引物的篩選 首先用160個(gè)引物分別對(duì)群體池DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選出多態(tài)性豐富且條帶清晰、主帶重復(fù)性好的引物。然后用篩選出來的引物對(duì)健康和自咬樣體基因組池進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增總體積為25μL，其中滅菌水16.3μL，10×Buffer（含鎂離子）2.5μL，dNTP（10mmol／L）2.0 μL，隨機(jī)引物2.0μL，Taq酶IU，DNA模板100 ng。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸1.5min，循環(huán)45次；72℃10min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。

1.3 RAPD標(biāo)記向SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化 根據(jù)測序結(jié)果，使用PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)出SCAR標(biāo)記的特異引物，反應(yīng)體系總體積為25μL，其中滅菌水16.3μL，10×Buffer（含鎂離子）2.5μL，dNTP（10 mmol／L）2.0μL，隨機(jī)引物2.0μL，Taq酶IU，DNA模板100ng。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，43.9℃退火1min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)45次；72℃10min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選及健康與食毛貉子PCR電泳檢測

在160個(gè)隨機(jī)引物中，篩選出15個(gè)擴(kuò)增良好且多態(tài)性較好的引物（圖1），其中，健康和食毛貉子基因組中，引物B7分別擴(kuò)增出5條共有和特異性標(biāo)記片1條B7－900（圖2）。

2.2 RAPD特異標(biāo)記的SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證回收、克隆上述RAPD特異標(biāo)記片段，經(jīng)測序后獲得這個(gè)片段的全序列（圖3），其中，貉子B7－900基因序列的長度為867bP。將所測序列與CenBank中的Blast序列進(jìn)行比較，從比較結(jié)果得知所測的B7－900擴(kuò)增序列與人類角蛋白基因同源性達(dá)79%。

用SCAR引物對(duì)健康和食毛貉子進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果（圖4）。引物SMB7－217在56個(gè)健康個(gè)體中有49個(gè)個(gè)體出現(xiàn)了和特異性目的條帶一致的條帶，其余7個(gè)個(gè)體沒有特異性條帶。在31個(gè)患病個(gè)體中有8個(gè)個(gè)體出現(xiàn)了和特異性目的條帶一致的條帶。卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，特異SCAR引物在健康和食毛樣體之間的組成比例差異極顯著（P＜0.01）。說明此RAPD標(biāo)記SMB7－217已成功轉(zhuǎn)化為顯性的SCAR標(biāo)記（表1）。

表1 SMB7－217標(biāo)記在健康和食毛個(gè)體中分布情況

3 討論

動(dòng)物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)常受到各種病原物的侵襲，表現(xiàn)為抗病或感病。動(dòng)物疾病是現(xiàn)代畜禽業(yè)生產(chǎn)的大敵，疾病不僅嚴(yán)重威脅著動(dòng)物的健康，而且還給畜禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（國外估計(jì)疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失約占畜牧業(yè)總產(chǎn)值的12%～15%）［7］。從長遠(yuǎn)來看，采用遺傳學(xué)方法從遺傳本質(zhì)上提高動(dòng)物對(duì)病原的抗性，加強(qiáng)免疫功能，開展抗病育種具有治本的功效?？共×Π催z傳機(jī)制不同可分為特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力指畜禽對(duì)某種特定病原體的抗性，這種抗性主要受一個(gè)基因位點(diǎn)控制，也可不同程度的受其他多個(gè)位點(diǎn)及環(huán)境的影響。研究結(jié)果表明，特殊抗病力的內(nèi)在機(jī)理在于宿主體內(nèi)存在或缺少某種分子或其變體［8］。一般抗病力不只抗某一種病原體，它受多基因和環(huán)境的共同影響，畜體不存在一般抗病力的單基因，一般抗病力受多基因及環(huán)境影響［9］。隨著分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，人們可以方便而快捷地進(jìn)行畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀（包括抗病力）的標(biāo)記輔助選擇。標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)被廣泛的運(yùn)用到現(xiàn)代畜禽育種實(shí)踐中。

圖4 SMB7－217引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

角蛋白是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于生物體的組織結(jié)構(gòu)中。在不同機(jī)體組織、不同個(gè)體乃至不同物種之間角蛋白含量有較大差異。高等脊椎動(dòng)物的上皮組織中角蛋白含量較高［10］；根據(jù)是否纖維化，角蛋白可分為軟角蛋白和硬角蛋白兩大類。軟角蛋白和硬角蛋白的含硫氨基酸含量有所不同，軟角蛋白存在于皮膚和其他一些細(xì)胞組織中。纖維化的硬角蛋白，無營養(yǎng)作用，廣泛存在于人和動(dòng)物的表皮及蛋殼的內(nèi)膜中［11］。細(xì)胞外的硬角蛋白是構(gòu)成毛發(fā)、羽毛、蹄、殼、爪、角、鱗片等的主要成分［12］，是結(jié)締組織及其重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著保護(hù)機(jī)體的作用。細(xì)胞內(nèi)的軟角蛋白是構(gòu)成細(xì)胞膜、腦灰質(zhì)、脊髓、視網(wǎng)膜神經(jīng)等組織的主要成分。角蛋白由L－氨基酸按一定的次序排列而成［13］，Parry 等［14］發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物毛發(fā)纖維的氨基酸重復(fù)單元中主要有兩種基本的五肽環(huán)模式的重復(fù)單元，即：重復(fù)單元A（CC－X－P－X）和B（C－C－X－S／T－S／T），這里 C 代表半胱氨酸（Cys），P 代表脯氨酸（Pro），S代表絲氨酸（Ser），T 代表蘇氨酸（Thr），X 代表除這幾種之外的構(gòu)成蛋白質(zhì)的任何一種氨基酸。由此我們推測貉子食毛癥可能與貉子機(jī)體含硫氨基酸的合成和吸收有關(guān)。這一結(jié)論與彭毛［1］的研究結(jié)果不謀而合。

本試驗(yàn)采用基于RAPD的SCAR標(biāo)記法對(duì)貉子食毛癥進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明，健康和患病貉子群體的存在較明顯的遺傳差異。這一研究結(jié)果可作為貉子食毛癥早期診斷的分子生物學(xué)手段，逐漸剔除食毛個(gè)體，達(dá)到凈化貉子群體的目的，減少貉子飼養(yǎng)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。并為進(jìn)一步對(duì)貉子食毛癥的深入研究奠定基礎(chǔ)。

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