雙歧桿菌對應激模型大鼠腸道通透性的影響Δ

冀建偉，付蕾，鄭鵬遠，張軍（.鄭州大學第二附屬醫(yī)院，鄭州45004；.鄭州大學藥學院，鄭州45000）

雙歧桿菌對應激模型大鼠腸道通透性的影響Δ

冀建偉1＊，付蕾2，鄭鵬遠1#，張軍1（1.鄭州大學第二附屬醫(yī)院，鄭州450014；2.鄭州大學藥學院，鄭州450001）

目的：研究雙歧桿菌對應激模型大鼠腸道通透性的影響及其與蒙脫石散聯(lián)用的協(xié)同作用。方法：取SD大鼠50只隨機均分為正常對照組、模型對照組、雙歧桿菌干預組（2×108cfu）、蒙脫石散干預組（0.6g·kg－1）及其聯(lián)合干預組（雙歧桿菌2×108cfu+蒙脫石散0.6g·kg－1），每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7d，后4組每日給藥后以避水壓力模型（WAS）方法建立大鼠應激模型。第8天各組分別灌胃給予探針藥物甘露醇80mg、三氯蔗糖60mg，檢測各組大鼠給藥后5、24h尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量及其比值，以評價腸道通透性。實驗結(jié)束處死大鼠，檢測各組大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的含量。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠24h尿液中甘露醇的量及血清中CRF、ACTH含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，雙歧桿菌干預組和聯(lián)合干預組ACTH含量均明顯降低（P＜0.05），其余指標均有降低，但沒有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：雙歧桿菌對應激模型大鼠的腸道通透性有影響，其與蒙脫石散聯(lián)用對應激所致的腸道屏障功能紊亂無協(xié)同作用。

雙歧桿菌；應激模型；大鼠；腸道通透性；蒙脫石散

益生菌是人類腸道的原籍菌，在維持宿主胃腸道正常生理功能中發(fā)揮著重要作用。雙歧桿菌是人類腸道最早發(fā)現(xiàn)的益生菌，極具研究價值。盡管大量的數(shù)據(jù)顯示，益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道免疫[1]、阻滯病原菌黏附、提高黏膜屏障功能[2，3]，但其在應激所致的腸道屏障功能紊亂中的治療作用研究較少。蒙脫石散是臨床上常用的腸道黏膜屏障保護劑，是一種特有的不吸收、不會造成全身性不良反應，且應用方便、經(jīng)濟的口服制劑。蒙脫石散在維持腸道黏膜機械屏障、穩(wěn)定腸道微生態(tài)環(huán)境等方面可發(fā)揮重要作用，能夠有效地預防和控制腸道病原菌生物移位的發(fā)生。在本實驗中，筆者擬以避水壓力模型（WAS）方法模擬環(huán)境和心理壓力建立應激模型大鼠，研究雙歧桿菌對應激模型大鼠腸道通透性的影響及其與蒙脫石散聯(lián)用是否具有協(xié)同作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectra MR型酶標儀（美國Dynex公司）；Agilent 6890N氣相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）。

1.2 試藥

蒙脫石散（博福-益普生（天津）制藥有限公司，批號：T0461，規(guī)格：每袋3g）；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒（美國ADL公司）；甘露醇（比利時Acros公司，純度：98%）；三氯蔗糖（純度：99%）、α-D-甲基甘露糖苷（內(nèi)標1，純度：99%）、蔗糖（內(nèi)標2，純度：99%）均由美國Sigma公司提供。

1.3 益生菌

雙歧桿菌（鄭州大學醫(yī)學微生態(tài)學研究所，分離自內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片）。

1.4 動物

SD大鼠，♀，清潔級，體重（200±20）g，由鄭州大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK（豫）2005-0001。

2 方法

2.1 分組與給藥

取大鼠50只，隨機均分為正常對照組（生理鹽水2mL）、模型對照組（生理鹽水2mL）、雙歧桿菌干預組（2×108cfu）、蒙脫石散干預組（0.6g·kg－1）及其聯(lián)合干預組（雙歧桿菌2×108cfu+蒙脫石散0.6g·kg－1），每日上午8：00灌胃給予相應藥物1次，連續(xù)給藥7d。

2.2 建模

采用WAS方法。每日稱重、給藥后，除正常對照組外其余各組大鼠均放置于一個8cm×6cm的平臺上，平臺固定在一個直徑50cm、深50cm的有水塑料容器內(nèi)，離水面的距離為1cm[2]，每次放置2h（上午8：00－10：00）。

2.3 腸道通透性測定

本實驗以大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量及其比值來評價其腸道通透性。

2.3.1 糖攝取與尿液采集。實驗第8天上午8：00，各組大鼠分別灌胃給予探針藥物甘露醇80mg、三氯蔗糖60mg，然后放入大鼠代謝籠，3h后自由飲水，整個過程中禁食[4]。收集給藥后5h及其后19h尿液，記錄尿液體積。實驗結(jié)束后將采集到的尿液置于－20℃條件下儲存，待測。

2.3.2 樣品的制備。取給藥后5h及其后19h尿液各100μL，分別加入20μL混合內(nèi)標溶液（含5mg·mL－1內(nèi)標1與2mg·mL－1內(nèi)標2），混勻后70℃下氮氣吹干，干燥物加入200μL含25mg·mL－1鹽酸羥胺的無水吡啶溶液，70℃反應1h后，2250r·min－1離心5min，取100μL上清液至小錐形瓶中，加入100μL N-三甲硅烷基咪唑，70℃反應30min，將得到含硅烷化衍生物的尿液密封儲存于－20℃冰箱中，待測。另向正常健康大鼠的空白尿液中加入已知量的混合探針藥物制成標準品（高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品）進行平行分析。

2.3.3 色譜條件。色譜柱：HP-5（5%苯甲基硅烷）柱（30m×320μm，0.25μm）；載氣：氮氣，流速：1.0mL·min－1；柱溫[5]：程序升溫，初始溫度220℃，保持5min，然后以10℃·min－1升溫2min，5℃·min－1升溫4min，3.5℃·min－1升溫4min后達到最終溫度274℃，保持7min，整個操作時間為22min；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；檢測器溫度：280℃；進樣口溫度：250℃；手動進樣；進樣量：2μL。同時檢測甘露醇和三氯蔗糖的量。每種糖的含量由相應標準品的保留時間（tR）來確定，按內(nèi)標標準曲線法計算樣品中每種糖的量，甘露醇的量：m甘/m內(nèi)標1＝A甘/A內(nèi)標1，三氯蔗糖的量：m三/m內(nèi)標2＝A三/A內(nèi)標2。式中，m甘：甘露醇的質(zhì)量，m內(nèi)標1：內(nèi)標1的質(zhì)量，A甘：甘露醇的峰面積，A內(nèi)標1：內(nèi)標1的峰面積，m三：三氯蔗糖的質(zhì)量，m內(nèi)標2：內(nèi)標2的質(zhì)量，A三：三氯蔗糖的峰面積，A內(nèi)標2：內(nèi)標2的峰面積。在上述色譜條件下，內(nèi)標1、甘露醇、內(nèi)標2、三氯蔗糖的保留時間分別是3.5、4.6、13.7、14.6min。

2.3.4 系統(tǒng)適用性與方法學研究。在“2.3.3”項色譜條件下，甘露醇峰和三氯蔗糖峰與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于6000，拖尾因子在0.95～1.05之間，RSD小于2%。甘露醇檢測濃度在0.5～20mg·mL－（1r＝0.999，n＝8）、三氯蔗糖檢測濃度在0.05～2mg·mL－（1r＝0.998，n＝8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。日內(nèi)、日間RSD均小于10%，相對回收率均大于90%。

2.4 血清中CRF、ACTH含量的檢測

實驗結(jié)束日處死大鼠，收集各組大鼠血液，室溫下凝固20min，4℃、4000r·min－1離心30min，分離血清，采用CRF、ACTH ELISA試劑盒測定各組大鼠血清中CRF和ACTH的含量，以確定大鼠是否產(chǎn)生應激反應。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 腸道通透性指標

給藥后5h，各組大鼠腸道通透性指標比較無顯著性差異。與正常對照組比較，模型對照組大鼠給藥后24h尿液中甘露醇的量明顯升高（P＜0.05），表明應激條件下大鼠腸道通透性增強。各組大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量見表1。

表1 各組大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量比較（mgn＝10）Tab 1Comparison of the amount of mannitol and sucralose in urin（emg

表1 各組大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量比較（mgn＝10）Tab 1Comparison of the amount of mannitol and sucralose in urin（emg

與正常對照組比較：＊P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05

給藥后5h三氯蔗糖4.198±0.3123.700±0.3533.619±0.2683.645±0.3063.625±0.298組別正常對照組模型對照組雙歧桿菌干預組蒙脫石散干預組聯(lián)合干預組甘露醇1.849±0.2062.163±0.2761.996±0.1882.030±0.2941.924±0.309三氯蔗糖1.780±0.1911.987±0.2291.837±0.2701.870±0.3131.862±0.225給藥后24h甘露醇3.774±0.3194.078±0.362＊3.802±0.2903.861±0.3353.845±0.296

3.2 血清中CRF、ACTH含量變化

與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中CRF、ACTH含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，雙歧桿菌干預組和聯(lián)合干預組大鼠血清中ACTH含量均明顯降低（P＜0.05）。表明在應激條件下，大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌處于應激狀態(tài)，而雙歧桿菌對這種應激狀態(tài)有緩解作用。各組大鼠血清中CRF、ACTH含量比較見表2。

表2 各組大鼠血清中CRF、ACTH含量比較（pg·L－1n＝10）Tab 2Comparison of serum levels of CRF and ACTH in each grou（ppg·L－1

表2 各組大鼠血清中CRF、ACTH含量比較（pg·L－1n＝10）Tab 2Comparison of serum levels of CRF and ACTH in each grou（ppg·L－1

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型對照組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model control group：#P＜0.05

項目CRF ACTH組別聯(lián)合干預組277.8±31.95.94±0.650#正常對照組267.0±32.35.68±0.799模型對照組300.8±34.3＊6.79±0.651＊雙歧桿菌干預組279.5±29.65.92±0.477#蒙脫石散干預組281.6±32.36.24±0.787

4 討論

近年來，社會心理因素對壓力相關(guān)性（Stress-associated）疾病如肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病以及疼痛和慢性疲勞綜合征的影響日益受到關(guān)注[6，7]。越來越多的學者認為生活壓力能夠?qū)е禄蚣又毓δ苄阅c病如腸易激綜合征（IBS）[8，9]以及炎癥性腸?。↖BD）如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎[9，10]。IBS是一種最常見的消化系統(tǒng)功能性疾病，近年的發(fā)病率亦逐年升高。研究[11]發(fā)現(xiàn)，應激刺激能夠影響胃腸道的蠕動、分泌等功能，并且可以增加旁細胞途徑的滲透，而IBS和IBD患者大多存在腸道屏障功能紊亂。腸道通透性測定是評估腸道屏障完整性最直接、準確的方法。腸道通透性可以通過測定口服攝入大分子探針藥物在尿液中的排泄來完成[12]。應用最廣泛的探針藥物是糖類化合物，如蔗糖、甘露醇、乳果糖等。其中，口服甘露醇和三氯蔗糖在胃腸道的不同部位被較少吸收，大部分以原型通過糞便排泄，其余以原型從尿液排泄[13]。因此，口服一定量的糖探針溶液，并測定其在尿液中的排泄量，就可以選擇性地反映胃腸道不同位置的屏障完整性。乳果糖與甘露醇比例曾是許多科研和臨床研究中評估小腸通透性的重要工具。但由于乳果糖易被結(jié)腸細菌分解，改變結(jié)腸pH并可能改變結(jié)腸微生物群、改變腸道通透性，因此不宜選用。三氯蔗糖是蔗糖氯化后的一種人工合成二糖，其不僅對熱穩(wěn)定，而且在通過整個消化道時幾乎不被代謝，并且與蔗糖和乳果糖有相似的分子量。因此本實驗選用甘露醇和三氯蔗糖作為檢測大鼠腸道通透性的探針藥物。

毛細管氣相色譜法（CCGC）是一種研究腸道通透性的新方法，具有實用、可重復、準確、靈敏度高等優(yōu)點。本實驗采用CCGC法，2種糖都能在相同條件下同時檢測，降低了誤差。筆者在預實驗中發(fā)現(xiàn)由于甘露醇與三氯蔗糖在CCGC中tR相差較大（＞8），因此選擇了雙內(nèi)標法進行測定。在本實驗中，24h大鼠排泄的三氯蔗糖和甘露醇幾乎一半出現(xiàn)在了5h尿液中，另外一半出現(xiàn)在后19h的尿液中。一般認為前5h為糖探針通過小腸以上胃腸道特別是小腸的時間，而后19h則代表其通過大腸特別是結(jié)腸的時間[14]。本實驗中，與正常對照組比較，應激模型大鼠前5h的腸道通透性無變化，而24h的腸道通透性發(fā)生改變，說明WAS應激可能對結(jié)腸的通透性影響較大。

應激模型大鼠出現(xiàn)腸道通透性的改變可能與CRF有關(guān)。筆者前期體外研究顯示腸黏膜嗜酸細胞在SP（Substance P）的作用下可以產(chǎn)生并釋放CRF[15]，而使用CRF受體阻滯藥可以顯著改善應激所導致的腸道屏障功能紊亂[16]。在本實驗中，應激模型大鼠出現(xiàn)腸道通透性改變，血清中CRF、ACTH含量明顯升高，而雙歧桿菌干預組和聯(lián)合干預組的ACTH含量明顯降低，且接近正常對照組，說明應激能夠?qū)е麓笫笊窠?jīng)內(nèi)分泌紊亂，而雙歧桿菌對應激模型大鼠的腸道通透性有影響。但應激模型大鼠出現(xiàn)腸道屏障功能紊亂與CRF之間的具體關(guān)系目前尚不清楚，仍需進一步研究。

與雙歧桿菌干預組和蒙脫石散干預組比較，聯(lián)合干預組大鼠的腸道通透性指標血清中CRF、ACTH含量均無顯著性差異，說明雙歧桿菌與蒙脫石散聯(lián)用對應激所致的腸道屏障功能紊亂無協(xié)同作用。

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Influence of Bifidobacterium on the Intestinal Permeability in Stress Model Rats

JI Jian-wei，ZHENG Peng-yuan，ZHANG Jun（The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，China）
FU Lei（School of Pharmacy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE：To study the improvement effect of Bifidobacterium on intestinal permeability in stress model rats，and synergistic reaction of Bifidobacterium combined with Montmorillonite powders.METHODS：50SD rats were randomly divided into normal control group，model control group，Bifidobacterium treatment group（2×108cfu），Montmorillonite powders treatment group（0.6g·kg－1）and drug combination group（Bifidobacterium 2×108cfu+Montmorillonite powders 0.6g·kg－1）.Those rats were given medicine once a day via i.g.for consecutive 7days.Stress model was established by WAS in the latter 4groups.On 8th day each group was given mannitol 80mg and sucralose 60mg，and the amount and ratio of mannitol and sucralose in urine were determined 5h and 24h after administration to evaluate intestinal permeability.Rats were sacrificed at the end of experiment，and the content of corticotrophin releasing factor（CRF）and adrenocorticotrophic hormone（ACTH）in serum were determined.RESULTS：Compared with normal control group，the 24h mannitol concentration，the serum levels of CRF and ACTH in model control group increased significantly（P＜0.05）.Compared with model control group，serum levels of ACTH in Bifidobacterium treatment group and drug combination group decreased significantly（P＜0.05）.Other parameters all decreased but had no statistical significance.CONCLUSION：Bifidobacterium can improve intestinal permeability of stress model rats，protect intestinal mucosa.In the treatment of intestinal dysfunction caused by chronic psychological stress，Bifidobacterium and Montmorillonite powders are not in synergies.

Bifidobacterium；Stress model；Rats；Intestinal permeability；Montmorillonite powders

R965

A

1001-0408（2012）17-1543-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.17.03

Δ國家自然科學基金資助項目（30772028）

＊藥師。研究方向：消化系統(tǒng)藥物臨床合理應用。電話：0371-63974693。E-mail：jiwei_2002@163.com

#通訊作者：教授，博士研究生導師。研究方向：消化系統(tǒng)藥物臨床合理應用。電話：0371-63974693

2011-05-16

2011-08-04）