脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細胞凋亡及Bax、Bcl-2表達的影響1）

李雅蓉，李 興

近年多項研究表明，在眾多脂肪細胞分泌的蛋白和代謝物中，脂聯(lián)素（ADPN）是唯一提高胰島素敏感性、對心血管具有保護作用因子。本研究旨在探討脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下心肌細胞凋亡的影響，以揭示脂聯(lián)素對糖尿病心肌?。―CM）中心肌細胞的可能保護機制，為防治糖尿病心肌病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人心肌細胞株（HCM）購于美國SinceCell公司上海代購，DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司），胰蛋白酶（北京Solarbio公司），胎牛血清（美國HyClone公司），D-葡萄糖（北京Solarbio公司），MTT試劑盒（美國Sigma公司），脂聯(lián)素（Human gAcrp美國Pepro Tech公司），Trizol試劑（上海生工生物工程有限公司），F(xiàn)astStart Universal SYRB Green Master（ROX，美 國 Roche 公 司 ）。Bax 引 物，上 游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下 游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3′。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下 游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184bp（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 人心肌細胞的培養(yǎng)及分組 HCM培養(yǎng)于含10%胎牛血清，5.5mmol／L D-葡萄糖，100U／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃含5%的CO2的孵箱中孵育，細胞生長至約85%融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。正常對照組D-葡萄糖濃度5.5mmol／L；高糖組D-葡萄糖濃度30.0mmol／L；高糖加脂聯(lián)素組D-葡萄糖濃度30.0mmol／L+ADPN 2.5μg／mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法 取部分生長狀態(tài)佳的細胞，以1×104個／mL接種至96孔板，待細胞貼壁后，改用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6h。按照實驗分組進行干預，每組設3個復孔，同時設凋零孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入 MTT 20μL，孵育4h后，每孔加入DMSO150μL，振蕩10min，待DMSO溶解后，于酶標儀490nm處測得吸光度OD值。

1.3.2 流式細胞術 取部分生長狀態(tài)佳的細胞，以1×105個／mL接種至6孔板，待細胞貼壁后，改用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6h，使細胞同步化，棄去培養(yǎng)液，按照實驗分組進行干預，每組設3個復孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h，用脂結合蛋白AnnexinV／碘化丙啶（PI）雙染色標記后，流式細胞儀測細胞的凋亡百分率。結果判斷，正?；罴毎鸄nnexinV／PI均低染；凋亡細胞AnnexinV高染，PI低染；壞死細胞AnnexinV／PI均高染。

1.3.3 熒光定量PCR 總RNA的提取，細胞生長至約80%融合時，棄去培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基6h后，按實驗分組進行干預，棄去上清，加入Trizol試劑提取總RNA。將RNA反轉錄為 cDNA。 目 的 基 因 Bax 引 物，上 游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下 游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下 游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184bp。PCR反應體系：FastStart U-niversal SYRB Green Master（ROX），上游引物（15μmol），下游引物（15μmol），cDNA，無DNAse和RNAse水。PCR反應條件：95℃變性10min，95℃15s，58℃45s，共45個循環(huán)。由PCR反應曲線得到Ct值，采用2-△△Ct方法計算相對定量結果。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析進行組間比較。

2 結 果

2.1 MTT結果 與對照組相比，高糖組細胞在24h時，細胞增殖增加，48h、72h細胞增殖受到抑制（P＜0.05）。脂聯(lián)素組與高糖組相比，24h時細胞增殖情況無統(tǒng)計學意義，48h、72h細胞增殖明顯增加（P＜0.05）。詳見表1。

表1 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下心肌細胞增殖的影響（OD值）（x±s）

2.2 流式細胞術 與對照組相比，高糖組的細胞在各個時間段凋亡率均增加（P＜0.05）。脂聯(lián)素組與高糖組相比，48h、72h細胞凋亡率均減少（P＜0.05）。各時間段脂聯(lián)素組之間差異有統(tǒng)計學意義，隨著時間推移，細胞凋亡率降低。詳見表2。

表2 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下心肌細胞凋亡率的影響（x±s） %

2.3 熒光定量PCR結果 與對照組相比，高糖組的細胞在各個時間段Bax的表達增加（P＜0.05），Bcl-2的表達降低（P＜0.05）。脂聯(lián)素組與高糖組相比，48h、72hBax表達下調（P＜0.05），而Bcl-2的表達上調（P＜0.05）。各時間段脂聯(lián)素組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即隨著時間推移，Bax表達下調，而Bcl-2上調。詳見表3。

表3 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下心肌細胞Bcl-2／Bax（2-△△Ct）表達的影響（x±s）

3 討 論

DCM是糖尿病引起的最常見和最嚴重的心血管并發(fā)癥，是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一。它是獨立于高血壓心臟病、冠心病、瓣膜病變引起的心臟病等以外的一種特異性心臟病，其主要的病理改變表現(xiàn)為心肌細胞肥大、心肌纖維化、細胞外基質沉積、心肌細胞凋亡增加等。臨床上早期主要表現(xiàn)為心臟舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，最終發(fā)展成為充血性心力衰竭。糖尿病心肌病的發(fā)病機制，目前尚未完全闡明，主要認為與心肌能量代謝紊亂［1，2］、血管及自主神經紊亂、胰島素抵抗［3］以及其他細胞因子的參與等有關。

高血糖是糖尿病心肌病的主要病因，而由高血糖引起的心肌細胞凋亡是導致糖尿病心肌病發(fā)病和病程進展的關鍵因素。本次研究MTT結果，高糖組24h細胞增殖增加，可能與細胞的應激有關。通過抗氧化作用和凋亡信號轉導途徑抑制細胞凋亡，可以阻止糖尿病引起的心臟毒性作用，表明在糖尿病心肌病的發(fā)展過程中，心肌細胞凋亡是一個重要因素。心肌細胞凋亡過程與多種途徑有關，包括凋亡／抗凋亡基因失調、線粒體凋亡通路、膜受體凋亡通路以及氧化、硝化應激等導致的細胞凋亡［4，5］。

Bcl-2家族是與細胞凋亡緊密相關的基因家族，該家族的蛋白產物從功能上分為兩類：一類具有抑制凋亡作用，如：Bcl-2、Bclxl、Mcl-1等；另一類則具有促進凋亡作用，如Bax、Bak、Bok等。生理情況下，抑制凋亡和促進凋亡的蛋白維持動態(tài)平衡，當機體或細胞受到有害刺激時，平衡被打破，出現(xiàn)細胞凋亡增加或發(fā)生腫瘤。Bcl-2家族成員之間雖然有功能上的重疊［6］，但是這些蛋白都是正常組織發(fā)育和維持自身穩(wěn)態(tài)所必需的。Bcl-2和Bax是目前研究比較明確的一對拮抗基因。Bcl-2是從濾泡B細胞瘤中克隆出的第一個抑制凋亡的蛋白，主要位于線粒體膜、滑面內質網及核膜上，可抑制多種原因引起的細胞程序性死亡；Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員，是一個可溶性蛋白分子，主要位于細胞質中，當凋亡信號發(fā)生時，Bax從胞質中轉移到線粒體，并與線粒體膜相結合，發(fā)揮促凋亡作用。Bcl-2在細胞中是以同源二聚體（Bax／Bax）或異源二聚體（Bax／Bcl-2）形式存在的，Bcl-2過渡表達與Bax構成異源二聚體而阻抑細胞凋亡，而當Bax過度 表 達 時， 形 成 Bax-Bax 同源二聚體可促進細胞凋亡［7］。細胞受到凋亡刺激信號后，Bcl-2／Bax表達產物的比值可能決定細胞是趨于存活還是死亡。當Bcl-2／Bax＞1時，對細胞凋亡起抑制作用，細胞趨向于存活；當Bcl-2／Bax＜1時，對細胞凋亡起促進作用，細胞趨向于死亡［7，8］。本實驗研究結果顯示，高糖環(huán)境下培養(yǎng)細胞，隨著時間推移，Bax表達增加，Bcl-2的表達則減少，加入脂聯(lián)素后，Bax表達下調，Bcl-2表達增加，抑制了細胞的凋亡。

脂聯(lián)素是近年來發(fā)現(xiàn)的由脂肪組織分泌的一種內源性生物活性多肽，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、提高胰島素敏感性及調節(jié)能量代謝等作用。流行病學調查顯示［9］，在肥胖、糖尿病和高血糖癥患者體內，脂聯(lián)素水平降低，并且導致心血管病風險增加。前期研究表明，T-鈣粘蛋白在1型糖尿病大鼠的心肌細胞膜及核周都有表達，其表達量與血清脂聯(lián)素水平成正相關，且隨著病變的進展表達逐漸增加［10］，而且脂聯(lián)素可以時間依賴性的增加高糖環(huán)境下心肌細胞T-鈣粘蛋白的表達，可能與氧化應激時T-鈣粘蛋白上調性表達有關，通過與脂聯(lián)素結合后激活磷脂酰肌醇-3-激酶信號途徑從而對抗氧化應激導致的細胞凋亡，并且可以提高細胞在氧化應激狀態(tài)下的生存能力［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可以通過影響凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達，通過影響二者的比例來抑制人心肌細胞凋亡，并且這種作用呈時間依賴性關系。

心肌細胞無分裂或再生能力，細胞凋亡的多少在很大程度上決定了心功能的損害程度，因此通過各種途徑減少心肌細胞凋亡是保護心肌的一個重要途徑，脂聯(lián)素這種抑制心肌細胞凋亡從而保護心血管的作用，為糖尿病心肌病的治療提供了新的思路，也為脂聯(lián)素應用于臨床提供了新的依據。

［1］ Herrero P，Peterson LR，McGill JB，et al.Increased myocardial fatty acid metabolism in patients with type 1diabetes mellitus［J］.Am Coll Cardiol，2006，47（3）：598-596.

［2］ van Herpen NA，Schrauwen-Hinderling VB.Lipid accumulation in non-adipose tissue and lipotoxicity［J］.Physiol Behav，2008，94（2）：231-241.

［3］ Lebeche D，Davidoff AJ，Hajjar RJ.Interplay between impaired calcium regulation and insulin signaling abnormalities in diabetic cardiomyopathy［J］.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2008 ，5（11）：715-724.

［4］ Chen S，Evans T，Mukheriee K，et al.Diabetes-induced myocardial structural changes：Role of endothelin-1and its receptors［J］.Mol Cell Cardiol，2000，32（9）：1621-1629.

［5］ Zhou YT，Grayburn P，Karim A，et al.Lipotoxic heart disease in obese rats：Implicati on for human obesity［J］.Proc Nati Acad Sci USA，2000，97（4）：1784-1789.

［6］ Rathmell JC，Lindsten T，Zong WX，et al.Deficiency in Bak and Bax perturbs thymic selection and lymphoid homeostasis［J］.Nat Immunol，2002，3（10）：932-939.

［7］ Schabitz WR，Sommer C，Zoder W，et al.Intravenous brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size and counterregulates Bax and Bcl-2expression after tempor ary focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2000，31（9）：2212-2217.

［8］ Isenmann S，Stoll G，Schroeter M，et al.Differential regulation of Bax，Bcl-2，and Bcl-X proteins in focal cortical ischemia in the rat［J］.Brain Pathol，1998，8（1）：49-62.

［9］ Zhu W，Cheng KK，Vanhoutte PM，et al.Vascular effects of adiponectin：Molecular mechanisms and potential therapeutic intervention［J］.Clin Sci（Lond），2008，114（5）：361-374.

［10］ 田臘梅，李興.脂聯(lián)素及T-鈣黏蛋白與大鼠糖尿病心肌病的關系［J］.中國糖尿病雜志，2008，16（8）：505-506.

［11］ 李淑帆，李興.脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細胞增殖及caspase-3、T-鈣黏蛋白表達的影響［J］.醫(yī)學研究雜志，2010，39（6）：58-60.