腺苷對大鼠缺血再灌注心肌IGF-1蛋白的影響

楊 柳，王 雄，張 慧，黃宏亮

急性心肌梗死已成為心血管事件中致死率很高的疾病，其主要治療方法是將閉塞的血管快速恢復(fù)血流供應(yīng)，減輕心肌組織損傷。然而，大量動物及臨床實(shí)驗(yàn)證明，缺血心肌再灌注可發(fā)生心律失常、梗死面積擴(kuò)大及心肌功能障礙。因此，在恢復(fù)缺血心肌血流供應(yīng)的同時能減輕缺血再灌注損傷已成為國內(nèi)外研究的主要課題。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察腺苷對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 雄性Wistar大鼠24只，體重250g±30g，山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室提供。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（iv組）、缺血再灌注模型組（I／R組）、缺血再灌注后腺苷處理組（AD組）。iv組只進(jìn)行手術(shù)不處理；I／R組缺血30min，再灌注2h；AD組缺血30min，再灌注2h，經(jīng)股靜脈緩慢注射腺苷［305μg／（kg·min）］，持續(xù)5min。腺苷（美國 Sigma公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）試劑盒均購自武漢博士德公司。HX-200動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；RN6240B型多道生理信號聚集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；BI-200醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 制備動物模型 取稱重后Wistar大鼠，應(yīng)用25%烏拉坦腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定手術(shù)臺上，經(jīng)氣管插管連接呼吸機(jī)，以針形電極置于四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于胸部左側(cè)第3～4肋骨處開口，并暴露縱膈及心臟，于左心耳下2mm處穿6-0絲線，結(jié)扎左冠狀動脈前降支（iv組只穿線不結(jié)扎），觀察肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高大于0.2mV，結(jié)扎30 min后松開血管，可見ST段回落，再灌注2h（AD組經(jīng)股靜脈注射腺苷5min）將大鼠處死，取出心臟浸泡于10%甲醛溶液中。

1.3 標(biāo)本檢測

1.3.1 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡 取梗死心肌組織，固定后石蠟包埋、切片，按照試劑盒提供方法操作，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞核呈棕黃色（TUNEL陽性），每張切片在400高倍鏡下隨機(jī)選取10個非重疊視野，計算凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)／心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.2 RT-PCR技術(shù)檢測miRNA-1 取100mg心肌組織，Trizol法提取總RNA，紫外吸收測定法檢測RNA純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Realtime PCR儀進(jìn)行PCR檢測，以U6作為內(nèi)參，miRNA-1的上游引物5′GGGGTGGAATGTAAAGAAG3′，下游引物5′TGCGTGTCGTGGAGTC3′。內(nèi)參U6的上游引物5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′， 下 游 引 物 5′ CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，數(shù) 據(jù) 采 用2-△△Ct法 進(jìn) 行 計算。

1.3.3 免疫組化（SP）法測IGF-1 取左心室前壁組織經(jīng)10%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，嚴(yán)格按SP試劑盒說明書進(jìn)行SABC法染色，DAB顯色，切片封固。400高倍鏡下觀察以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為IGF-1蛋白表達(dá)陽性。采用BI-200圖像分析系統(tǒng)測量平均光密度值，其光密度大小與IGF-1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組資料之間比較用方差分析，兩組之間比較用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞凋亡檢測 I／R組凋亡心肌細(xì)胞明顯增加，呈彌漫分布，AD組凋亡細(xì)胞較少，iv組偶見凋亡的心肌細(xì)胞。I／R組有較高的心肌細(xì)胞凋亡率，較iv組明顯增高（P＜0.05）。與I／R組比較，AD組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 IGF-1蛋白表達(dá)比較 與iv組相比，I／R組IGF-1蛋白表達(dá)率明顯增多（P＜0.05）；與I／R組相比，AD組IGF-1蛋白表達(dá)率增多（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組心肌組織IGF-1蛋白表達(dá)及凋亡指數(shù)（x±s）

2.3 心肌組織中miRNA-1的表達(dá)變化 與空白組相比，I／R組、AD組miRNA-1表達(dá)水平升高，升高后為原來的4.42倍和2.06倍。與I／R組相比，AD組miRNA-1表達(dá)水平降低，降低后為原來的2.15倍。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是指缺血的心肌細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)供血后產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷。現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷有著非常密切的關(guān)系［1］。其作用機(jī)制極為復(fù)雜，主要包括生成大量氧自由基，再灌注細(xì)胞內(nèi)鈣超載，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡及白細(xì)胞與血小板之間相互作用的關(guān)系等［2］。心肌持續(xù)性缺血導(dǎo)致組織損傷及細(xì)胞死亡，早期再灌注能夠有效減輕心肌缺血的損傷程度，但大量實(shí)驗(yàn)和臨床觀察，再灌注后改善心肌供血的同時又加重了單純心肌缺血造成的損傷，出現(xiàn)再灌注心律失常、梗死面積擴(kuò)大、心室收縮功能降低等情況。研究發(fā)現(xiàn)，腺苷可以通過多種途徑保護(hù)心肌缺血再灌注損傷，舒張冠狀動脈，加強(qiáng)心肌缺血預(yù)處理，減少心肌梗死范圍，減輕炎性反應(yīng)［3］等。腺苷使心肌的梗死面積明顯減少的同時增加了心肌缺血后的功能恢復(fù)，減輕了再灌注損傷，增強(qiáng)了心臟的保護(hù)作用［4］。腺苷通過作用于效應(yīng)器官上的腺苷受體完成生理功能，目前已知的受體亞型有四種，分別是A1、A2A、A2B、A3受體。其保護(hù)機(jī)制可能通過以下幾種方式：A1受體介導(dǎo)的抗親脂效應(yīng)穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少細(xì)胞內(nèi)乳酸產(chǎn)量和酸中毒，阻止脂質(zhì)過氧化；腺苷激活A(yù)1受體開放心肌鉀通道，引起心肌細(xì)胞超極化，減少鈣離子通過電壓門控通道，同時，抑制腺苷酸環(huán)化酶的激活，減少慢鈣通道的磷酸化，減少鈣離子通過該通道。最終減少心肌細(xì)胞鈣超載，起到心肌保護(hù)作用。腺苷激活A(yù)2A受體抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子，減少中性粒細(xì)胞的附壁作用，并減輕由中性粒細(xì)胞聚集和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的縮血管物質(zhì)的釋放，減少活化的血小板；腺苷激活A(yù)2受體明顯抑制腫瘤壞死因子α，可能有助于腺苷對再灌注后心肌保護(hù)的作用。Zhao等［5］證實(shí)，在再灌注階段使用腺苷激活A(yù)2A受體抑制細(xì)胞凋亡。A2受體的激活使活性氧的產(chǎn)生下降，繼而減少活性氧簇誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，可能是抑制細(xì)胞凋亡的途徑。Masakatsu等［6］研究表明，心肌梗死后腺苷A2B受體長期興奮使非梗死區(qū)心肌的纖維化降低，改善了心肌重塑，改善心臟功能。腺苷保護(hù)心肌的途徑有很多，但通過影響IGF-1蛋白含量來減輕心肌缺血再灌注損傷未見報道。本研究結(jié)果顯示，AD組較I／R組心肌組織中IGF-1蛋白含量明顯增加，細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，驗(yàn)證了腺苷通過增加IGF-1蛋白含量對心臟起保護(hù)作用。Shan等［7］研究顯示，miRNA-1轉(zhuǎn)錄后抑制IGF-1蛋白表達(dá)削弱了心肌細(xì)胞的抗凋亡作用。提示miRNA-1有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用。在大鼠心肌缺血再灌注損傷時，miRNA-1的水平會升高。在對比I／R組與AD組心肌組織中miRNA-1的表達(dá)及IGF-1蛋白含量變化時，發(fā)現(xiàn)AD組較I／R組IGF-1蛋白含量增加的同時miRNA-1表達(dá)下調(diào)，這表示腺苷有可能通過抑制miRNA-1的表達(dá)機(jī)制使IGF-1蛋白含量增加，從而達(dá)到減少心肌缺血再灌注損傷的作用，但由于樣本量較小其作用機(jī)制尚待大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)有助于認(rèn)識miRNAS在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制，并為腺苷防治和減輕心肌缺血性損傷提供新的研究資料和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Ray PS，Martin JL，Swanson EA，et al.Transgene overexpression of alphaB crystal-llin confers simultaneous protection against cardiomyoeyte apoptosis and necrosis during myocardial ischemia and reperfusion［J］.FASEB J，2001，15：393-402.

［2］ Kato R，F(xiàn)oex P.Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury：An update for anethesiologists［J］.Can J Anaesth，2002，4（98）：777-791.

［3］ Canyon SJ，Dobson GP.Protection against ventricular arrhythmias and cardiac death using adenosine and lidocaine during regional ischemia in the in vivo rat［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（3）：H1286-H1295.

［4］ Forman MB，Jackson EK.Role of adenosine in acute myocardial infarction［J］.J Am Coll Cardiol，2006，47（6）：1235-1236.

［5］ Zhao ZQ，Budde JM，Morris C，et al.Adenosine attenuates rperfusion induced apoptotic cell death by modulating expression of Bcl-2and Bax proteins［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33（1）：57-68.

［6］ Masakatsu W，Tetsuo M，Osamu S，et al.Long-term stimulation of adenosine A-B receptors begun after myocardial infarction prevents cardiac remodeling in rats［J］.Circulation，2006，114（18）：1923-1932.

［7］ Shan ZX，Lin QX，F(xiàn)u YH，et al.Upregulated expression of miR-l／miR-206in a rat model of myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，381（4）：597-601.