電針加灸對AD模型大鼠細胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinE、p21／cip的影響＊

夏微光 杜艷軍 孫國杰 熊 萍 劉若蘭

湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430065

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，是一種老年人常見病。臨床表現(xiàn)為認知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。如今人口老齡化已成為我國乃至全球性的社會問題，因此對AD的防治亦日益受到人們的重視。AD患者腦神經(jīng)元的凋亡比正常人高出30～50倍，所以細胞凋亡是引起AD患者腦神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因之一［1］。近年來的研究［2］發(fā)現(xiàn)，AD病理的發(fā)展及與其相關(guān)的細胞凋亡是細胞周期調(diào)控異常所致神經(jīng)元重新進入細胞分裂周期失敗的結(jié)果。cyclinE與p21／cip這兩種細胞周期蛋白表達的異常是導(dǎo)致細胞周期紊亂的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要原因之一。已有越來越多的臨床及動物實驗研究［3－5］表明，針灸治療AD療效肯定。本研究旨在通過電針加艾灸同時治療AD模型大鼠，探討電針和艾灸的協(xié)同作用對AD大鼠海馬區(qū)cyclinE、p21／cip表達的影響，以進一步闡明針灸防治AD的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

Wistar大鼠，雄性50只，鼠齡（10.0±2.0）個月，體重（360.0±20.0）g，SPF級（由湖北省疾控中心提供）。購進后適應(yīng)性喂養(yǎng)，正常飲食、飲水，7d后即開始進行Morris水迷宮測試，剔除不合格者（即反應(yīng)過于遲鈍或靈敏者），將合格大鼠40只稱重后隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、治療組，每組10只。

1.2 儀器及試劑

Morris水迷宮軟件公司（MT－200Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司），顱腦立體定位儀（編號：89－00136，國營西北光學(xué)儀器廠），微量注射器（寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠），BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。Aβ1－42（美國Sigma公司），兔抗大鼠cyclinE多克隆抗體（北京博奧森公司），兔抗大鼠p21／cip多克隆抗體（北京博奧森公司），生物素化山羊抗兔二抗工作液（北京中杉金橋公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），SDS－PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），生物素化山羊抗兔二抗工作液AP顯色液。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制作 參照劉靜等［6］的造模方法，將大鼠稱重，用10%水合氯醛（3.5ml／kg）麻醉后，按大鼠腦立體定位圖譜進行定位，在前囟后3.3mm，中線左右各旁開1.5mm，用牙科鉆鉆一小孔（直徑1mm），垂直插入微量注射器，使針尖自顱骨表面緩慢進入3mm至海馬區(qū)，用微量注射器分別注入5μl聚集肽的 Aβ1－42（按試劑說明，將0.1mg的 Aβ1－42單體用二甲基亞砜50μl溶解后，再加入0.01M的PBS 50μl稀釋配制成1μg／μl的溶液，37℃水浴箱孵育1周，使其變成寡聚狀態(tài)而具有神經(jīng)毒性，－20℃分裝保存）。5min內(nèi)注射完，注射后留針5min，按1.0 mm／min速度緩慢拔針，以免拔針時藥物溢出。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，局部外敷青霉素G粉，并于術(shù)后3d內(nèi)（包括當日）每日肌肉注射青霉素G粉10萬單位預(yù)防感染。

1.3.2 處理方法 正常組：正常喂養(yǎng)，不進行任何處理，作為實驗對照組；假手術(shù)組：顱內(nèi)注射與Aβ1－42等量生理鹽水，余同模型組；模型組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后即行造模，造模完畢后，大鼠正常喂養(yǎng)16d（以便藥物的吸收）后進行行為學(xué)檢測；治療組：造模完畢后，大鼠正常喂養(yǎng)3d后即行治療。取穴根據(jù)郭義［7］提供的大鼠穴位定位方法，針灸前將正常大鼠“百會”（頂骨正中）、“腎俞”（第2腰椎下兩旁）穴區(qū)直徑約1.5～2.0cm區(qū)域的鼠毛剪凈，暴露穴區(qū)皮膚，消毒，然后用1寸毫針對準百會穴刺入，當針尖刺到顱骨有阻力時調(diào)整方向，沿皮向后透刺約3～5mm，再用1寸毫針分別對準兩側(cè)腎俞穴向內(nèi)斜刺5mm，再把電針儀的正極接左側(cè)腎俞穴，負極接百會穴，開始通電，強度1 mA，連續(xù)波，頻率2Hz，時間15min，次日改正極接右側(cè)腎俞穴。電針治療完畢后在上三穴上方2～3cm采用特制艾條（直徑6mm）施以溫和灸，使穴位表皮溫度在（43.0±1.0）℃，每穴持續(xù)15min。上述操作每日1次，6d為1個療程，療程間休息1d，共治療2個療程后次日進行行為學(xué)檢測。

1.3.3 標本制備及檢測方法 將4組（每組10只）大鼠麻醉后快速斷頭取腦，剝離一側(cè)海馬稱重，剪碎置于勻漿器中，加入組織勻漿液（500μl裂解液加10μl PMSF加10μl磷酸酶抑制劑）置于冰盒中反復(fù)捻轉(zhuǎn)使組織盡量研碎，30min后轉(zhuǎn)入離心管，在4℃下12 000rpm離心30min，取上清采用BCA法測定樣品蛋白濃度。取80μg蛋白樣品放入97℃變性，用12%的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，剪取所需條帶，用含5%脫脂奶的TBST封閉1h，分別用兔抗cyclinE和兔抗p21／cip多克隆抗體（1∶100）孵育4℃過夜，用生物素化山羊抗兔二抗37℃孵育1h，AP顯色液顯色（取NBT、BICP液各4μl加入992μl的APbuffer中，滴在轉(zhuǎn)有目的蛋白的PVDF膜上，避光顯色），顯色充分后用清水中止。將目的條帶膜烘干保存，掃描后用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶吸光度（OD）值，對免疫印跡（Western blot）結(jié)果進行分析。另外，增加內(nèi)參照蛋白β－actin的檢測（兔抗β－actin多克隆抗體，Santa Cruz，1∶200），cyclinE、p21／cip的OD值分別與β－actin的OD值的比值作為觀察指標。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，用SNK檢驗對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

以Maker所顯示的條帶對應(yīng)的分子量作為參照確定cyclinE蛋白（51kDa）、p21／cip蛋白（21kDa）和β－actin蛋白（43kDa）的位置，結(jié)果在相應(yīng)的位置都出現(xiàn)了棕色的陽性反應(yīng)。見圖1。

圖1 cyclinE、p21／cip的表達（Western blot法）

用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶OD值，并與β－actin的OD值比較，結(jié)果顯示，cyclinE在模型組中的表達量明顯高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05），而治療組cyclinE表達明顯低于模型組（P＜0.05），且與正常組和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組p21／cip表達明顯低于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05），治療組明顯高于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠cyclinE、p21／cip蛋白表達的比較（n＝10，%，±s）

表1 4組大鼠cyclinE、p21／cip蛋白表達的比較（n＝10，%，±s）

與模型組比較＊ P＜0.05；與正常組比較△ P＜0.05

組別 cyclinE p21／ci p 0.5449±0.0198 0.8958±0.0490假手術(shù)組 0.5744±0.0050＊ 0.7594±0.0685＊△ 模型組 0.6958±0.0654△ 0.3764±0.0495△ 治療組 0.5604±0.0385＊ 0.5432±0.0604正常組＊△

3 討論

AD的病理特征之一是大量神經(jīng)元丟失。AD引起神經(jīng)元喪失的主要機制是細胞凋亡，神經(jīng)細胞調(diào)亡假說是AD病因病機學(xué)說的重要組成部分［8－9］。細胞周期需要細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）三者的相互作用來調(diào)控，以保證細胞分裂正常進行。AD患者腦內(nèi)正常的神經(jīng)細胞本來已停止分化，可長期存活，處于不可復(fù)原的狀態(tài)，即G0期，不再參與細胞增殖。如果cyclin、CDK或CKI三者的平衡被打破，細胞就會重啟細胞周期，而一旦進入有絲分裂后期出現(xiàn)障礙，致使細胞分裂失敗，就會導(dǎo)致細胞周期停滯，形成細胞凋亡［10］。Vincent等［11］首先報道，在AD患者腦中存在重新進入細胞周期的神經(jīng)元，由于CKI失活，導(dǎo)致G1／S控制點的失調(diào)。神經(jīng)元細胞一旦跨過G1／S控制點，就能夠進行DNA的復(fù)制，并且能夠進入G2期，但是細胞不能進行正常的分裂，所以就啟動凋亡程序，引發(fā)細胞凋亡。

cyclinE能使細胞越過G1／S期調(diào)控點，激活視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb），使其釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2Fs，E2Fs再促進cyclinE與CDK2結(jié)合形成cyclinECDK2復(fù)合體，后者進一步磷酸化pRb，充分釋放E2Fs，促進許多有關(guān)DNA復(fù)制的基因表達［12］。p21／cip屬于CKI中的一種，當DNA損傷和細胞衰老時，一方面，它能結(jié)合并抑制 cyclinD－CDK4、cyclinECDK2、cyclinA－CDK2等復(fù)合物的磷酸化活性，使Rb低磷酸化不能釋放E2F而致DNA合成受限，導(dǎo)致細胞不能進入S期，而停滯在G1期；另一方面，在p21／cip端有增殖細胞核抗原（PCNA）結(jié)合域，能覆蓋其某些功能區(qū)，使PCNA不能與DNA聚合酶δ形成復(fù)合物，或?qū)е翫NA全酶復(fù)合物不能在DNA單鏈上滑動，從而影響DNA的復(fù)制［13］。這樣就可以避免細胞重新進入分裂周期失敗所導(dǎo)致的凋亡。

Aβ由淀粉樣前體蛋白（APP）裂解而來，Aβ可引起氧化應(yīng)激、Ca2＋內(nèi)流，進而損傷線粒體，導(dǎo)致神經(jīng)細胞產(chǎn)能障礙，激活凋亡相關(guān)蛋白和因子，致使細胞周期異常，進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡或AD某種病理改變，發(fā)生AD。Aβ1－42疏水性強，更易聚集，更容易在特定腦區(qū)聚集沉積，導(dǎo)致AD中老年斑的形成［14］，所以本文用Aβ1－42蛋白片段復(fù)制AD大鼠模型的成功率比較高，技術(shù)也較熟練。

cyclinE表達于G1期，與CDK2結(jié)合后對細胞周期具有正性調(diào)控作用，而p21／cip有負性調(diào)控作用，這兩個細胞周期調(diào)節(jié)因子表達紊亂可致細胞周期紊亂，因此本文通過檢測cyclinE、p21／cip在AD模型大鼠海馬中的含量以期進一步闡明針灸治療AD的作用機制。結(jié)果顯示，模型組cyclinE含量比正常組和假手術(shù)組升高，p21／cip含量比正常組和假手術(shù)組明顯減少。過多的cyclinE能使神經(jīng)細胞越過G1／S期調(diào)控點，激活視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白以及其下游程序；p21／cip減少后不能抑制cyclin－CDK復(fù)合物的磷酸化活性，使得DNA能夠合成從而細胞進入S期，同時PCNA與DNA聚合酶δ形成復(fù)合物，DNA大量復(fù)制，細胞重新進入分裂周期，但在分裂后期失敗從而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。通過治療，cyclinE含量比模型組明顯降低，使細胞能維持在靜止狀態(tài)，從而避免凋亡程序的啟動；p21／cip含量比模型組明顯增多，它與大量的cyclin－CDK復(fù)合物結(jié)合導(dǎo)致DNA合成受阻，從而使細胞停滯在G1期，同時覆蓋PCNA某些功能區(qū)，阻止DNA的復(fù)制，防止細胞重新進入分裂周期產(chǎn)生凋亡。結(jié)果還顯示，假手術(shù)組p21／cip的表達與正常組比較亦存在一定的差異，這可能與模型復(fù)制過程中大鼠海馬存在不可避免的輕微損傷有關(guān)，但與模型組比較仍存在一定的差異性（P＜0.05）；同時，針灸治療組與正常組比較也存在一定的差異，但與模型組比較有顯著的好轉(zhuǎn)（P＜0.05）。筆者認為，就p21／cip蛋白而言，其未達到與正常組一致的水平可能與治療的療程或方法等有關(guān)，此點有待進一步研究。

中醫(yī)認為，癡呆病位在腦，其根本病機為精、氣、血不足導(dǎo)致腦髓失養(yǎng)，故治療原則為培腎固本、益精填髓。腦居顱內(nèi)，主靈機、記憶，司智力意識，支配感覺，統(tǒng)帥全身。督脈為“陽脈之海”、“入屬于腦”，與腦髓關(guān)系很密切，故有“病變在腦，首取督脈”的說法。百會穴屬督脈，居巔頂，手足三陽、足厥陰等經(jīng)交匯于此，為“三陽五會”，具有開竅醒神、補腦益智之功。腎為先天之本，藏精、生髓，腎俞穴為腎之背俞穴，腎之精氣皆轉(zhuǎn)輸匯集于此，腎經(jīng)與督脈相通，共同入髓絡(luò)腦，共主一身陽氣。故本實驗電針“腎俞”能補益腎精，使精氣上注于腦，從而生髓益腦，電針“百會”可激發(fā)陽氣，充養(yǎng)腦髓，提高記憶思維能力，艾灸上兩穴更可起到通經(jīng)活絡(luò)、益腎健腦之功。

綜上所述，電針加艾灸可以明顯改善AD模型大鼠海馬神經(jīng)元中細胞周期調(diào)節(jié)因子表達的不平衡，減少神經(jīng)元的凋亡，對AD起到固本培元、填精益髓的治療作用。但在AD發(fā)生發(fā)展的不同階段，通過治療，使細胞周期正負調(diào)節(jié)因子間達到怎樣一個具體的平衡還有待進一步研究。

［1］YUAN J，YANKNER BA.Apoptosis in the nervous system［J］.Nature，2000，407（6805）：802－809.

［2］NAGY Z.The dysregulation of the cell cycle and the diagnosis of Alzheimer＇s disease［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1772（4）：402－408.

［3］李建美，陳鳳蘭，李桂玲.開竅醒腦通絡(luò)法治療老年癡呆癥25例［J］.新中醫(yī)，2006，38（6）：71－72.

［4］劉勇前，何強，孫秀文.獨灸百會穴配合八仙益智粥治療老年期癡呆98例［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2003，31（4）：38－39.

［5］周冰，王瓊，馬俊.淺議針灸對老年期癡呆的調(diào)治［J］.針灸臨床雜志，2008，24（6）：45－46.

［6］劉靜，杜艷軍，李婧，等.艾灸預(yù)刺激對AD大鼠細胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinA，p21／cip的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22（11）：2612－2613.

［7］郭義.實驗針灸學(xué) ［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2008：360.

［8］莊瑩，陳杰.阿爾茨海默病病因及發(fā)病機制研究進展［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2008，29（2）：101－104.

［9］丁新生.老年性癡呆的病理、發(fā)病機制及其診斷研究［J］.中國臨床康復(fù)，2004，8（19）：3885－3887.

［10］謝朝陽，祝其鋒.細胞周期調(diào)控與阿爾茨海默病的研究進展［J］.中國老年學(xué)雜志，2004，24（4）：379－381.

［11］VINCENT I，ROSADO M，DAVIES P.Mitotic mechanisms in Alzheimer＇s disease？［J］.J Cell Biol，1996，132（3）：413－425.

［12］OBAYA AJ，SEDIVY JM.Regulation of cyclin－Cdk activity in mammalian cells［J］.Cell Mol Life Sci，2002，59（1）：126－142.

［13］馬驥，劉文超.細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑與腫瘤相關(guān)性的研究進展［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16（3）：315－316.

［14］JUNG SS，NALBANTOGLU J，CASHMAN NR.Alzheimer’s beta－amyloid precursor protein is expressed on the surface of immediately ex vivo brain cells：a flow cytometric study［J］.J Neurosci Res，1996，46（3）：336－348.