黃連、生地及其配伍對(duì)2型糖尿病大鼠治療作用的比較研究＊

楊明煒 趙 靜 鄒 欣 陸付耳

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030

黃連、生地配伍源自孫思邈《千金要方》，稱之為黃連丸，方中黃連清熱為君，生地滋陰為臣，共奏清熱滋陰之功效，主治消渴。臨床實(shí)踐［1－2］表明以黃連－生地藥對(duì)為基本方的一些制劑治療2型糖尿病具有良好療效，實(shí)驗(yàn)研究［3－5］也顯示黃連、生地和黃連－生地藥對(duì)具有明顯的降糖作用，但黃連配伍生地是否存在協(xié)同作用尚不清楚。因此，本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）尾靜脈注射的方法，誘導(dǎo)雄性SD大鼠建立2型糖尿病動(dòng)物模型，觀察比較黃連、生地及其配伍對(duì)2型糖尿病大鼠的治療作用，進(jìn)一步揭示黃連丸方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠105只，體重160～180g，購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：00007632），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18℃～22℃，濕度40%～70%，自然晝夜節(jié)律光照。

1.2 受試藥品

黃連、生地均購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥房（黃連產(chǎn)地：四川，批號(hào)：090501；生地產(chǎn)地：河南，批號(hào)：091201），黃連、生地及其配伍均采用水煎劑，濃度為1g／ml。

1.3 主要試劑

馬來鹽酸羅格列酮片（批號(hào)：H20020475）購(gòu)自葛蘭素史克公司；鏈脲佐菌素（批號(hào)：S0130）、戊巴比妥鈉（批號(hào)：P3761）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；IL－6ELISA 試劑盒（批號(hào)：ERC003）、IL－1βELISA 試劑盒（批號(hào)：ERC007）、TNF－αELISA 試劑盒（批號(hào)：ERC102α）購(gòu)自R＆D System公司；胰島素放免試劑盒（批號(hào)：S100930041）購(gòu)自中國(guó)原子能研究所；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：KMASUG）、三酰甘油檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：N0500906）、總膽固醇檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：N0501556）、游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A042）購(gòu)自南京建成有限公司；高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：6328）、低密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：6340）購(gòu)自北京康化康泰有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：11684817910）購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；免疫組化試劑盒（批號(hào)：ab7842）購(gòu)自美國(guó)ABcam公司。

1.4 模型建立與處理

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取13只大鼠作為正常組給予基礎(chǔ)飼料（70%碳水化合物、21%蛋白質(zhì)、9%蛋白質(zhì)）喂養(yǎng)，剩余大鼠給予高脂飼料（17%碳水化合物、25%蛋白質(zhì)、58%脂肪）喂養(yǎng)，5周后所有大鼠禁食12h（不禁水），高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，經(jīng)尾靜脈注射STZ 30mg／kg，正常組注射等體積等濃度的檸檬酸鹽緩沖液。1周后，所有大鼠禁食12h（不禁水），行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT），通過眼眶取血測(cè)血糖，空腹血糖＞7.8 mmol／L或者2h血糖＞11.1mmol／L被認(rèn)為造模成功。隨機(jī)選取體重接近的2型糖尿病大鼠65只，隨機(jī)分為模型組、羅格列酮組、黃連組、生地組、黃連＋生地組，每組13只，然后分別給予相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，模型組每日予以0.50ml／（kg·d）羧甲基纖維素鈉干預(yù)，羅格列酮組每日予以羅格列酮4.00mg／（kg·d）干預(yù)，黃連組每日予以黃連1.25g／（kg·d）干預(yù)，生地組每日予以生地2.50g／（kg·d）干預(yù)，黃連＋生地組每日予以黃連配伍生地3.75g／（kg·d）干預(yù)，干預(yù)過程中治療組和模型組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)。干預(yù)4周后，各組大鼠禁食12h（不禁水）后，行OGTT和胰島素釋放試驗(yàn)（insulin release test，IRT）。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

血糖采取葡萄糖氧化酶法測(cè)定；血清胰島素采用放免法測(cè)定；三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）采用酶法測(cè)定；胰島素曲線下面積（INSAUC）采用INSAUC（INS0＇＋I(xiàn)NS180＇）／2＋I(xiàn)NS30＇＋I(xiàn)NS60＇＋I(xiàn)NS120＇計(jì)算；胰島素敏感指數(shù)（ISI）采用李光偉等［6］方法計(jì)算，ISI＝In1／FBG（mmol／L）× FBI（mIU／L）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)后，符合正態(tài)分布后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）方法。

2 結(jié)果

2.1 黃連、生地及其配伍對(duì)大鼠 OGTT、INSAUC、ISI的影響

與正常組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)血糖均顯著升高，INSAUC顯著減小，ISI顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組各時(shí)間點(diǎn)血糖均顯著降低，INSAUC顯著增加，ISI顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與黃連＋生地組比較，黃連、生地各單藥組各時(shí)間點(diǎn)血糖水平均顯著高于復(fù)方組，INSAUC顯著小于復(fù)方組，ISI顯著低于復(fù)方組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1－2。

表1 各組血糖比較（n＝13，mmol／L，±s）

表1 各組血糖比較（n＝13，mmol／L，±s）

與模型組比較＊ P＜0.01；與黃連＋生地組比較△ P＜0.01

血糖組別0min 30min 60min 120min正常組 4.94±1.338＊△ 10.58±1.664＊△ 13.75±2.478＊△ 6.38±1.308＊△ 模型組 14.95±2.561△ 29.07±2.621△ 32.25±2.458△ 24.36±1.129△ 黃連組 8.87±1.398＊△ 23.21±2.267＊△ 26.91±2.034＊△ 18.52±1.229＊△ 生地組 8.05±1.704＊△ 25.02±2.168＊△ 28.06±2.244＊△ 18.46±1.119＊△ 黃連＋生地組 7.45±1.297＊ 21.00±2.654＊ 24.03±2.38＊ 14.68±1.190＊ 羅格列酮組 8.63±1.746＊ 18.97±2.565＊ 32.25±2.458＊ 14.49±1.152＊

表2 各組INSAUC和ISI比較（n＝13，±s）

表2 各組INSAUC和ISI比較（n＝13，±s）

與模型組比較＊ P＜0.01；與黃連＋生地組比較△ P＜0.01

組別 ISI INSAUC（mIU／L）正常組 82.03±3.019＊△ －3.04±0.127＊△ 模型組 42.50±3.888△ －4.82±0.058△ 黃連組 53.02±3.495＊△ －3.87±0.254＊△ 生地組 53.09±4.152＊△ －3.91±0.234＊△ 黃連＋生地組 67.33±3.421＊ －3.47±0.215＊ 羅格列酮組 67.79±3.191＊ －3.46±0.116＊

2.2 黃連、生地及其配伍對(duì)大鼠血清TG、TC、LDL－C及HDL－C的影響

與正常組比較，模型組血清TG、TC、LDL－C顯著升高，HDL－C顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組血清 TG、TC、LDL－C顯著降低，HDL－C顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與黃連＋生地復(fù)方組比較，黃連、生地各單藥組血清 TG、TC、LDL－C顯著高于復(fù)方組，HDL－C顯著低于復(fù)方組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組動(dòng)物血脂的變化（n＝13，mmol／L，±s）

表3 各組動(dòng)物血脂的變化（n＝13，mmol／L，±s）

與模型組比較＊ P＜0.01；與黃連＋生地組比較△ P＜0.01

TG TC LDL－C HDL－C正常組 0.55±0.109＊△ 1.27±0.216＊△ 0.23±0.059＊△ 0.96±0.119組別＊△模型組 1.35±0.132△ 2.28±0.252△ 0.75±0.102△ 0.35±0.120△ 黃連組 0.93±0.135＊△ 1.88±0.229＊△ 0.56±0.125＊△ 0.55±0.136＊△ 生地組 0.94±0.131＊△ 1.89±0.233＊△ 0.54±0.130＊△ 0.55±0.124＊△ 黃連＋生地組 0.76±0.130＊ 1.56±0.170＊ 0.36±0.116＊ 0.76±0.121＊ 羅格列酮組 0.76±0.120＊ 1.51±0.212＊ 0.35±0.109＊ 0.76±0.107＊

3 討論

近年來，全球糖尿病患者數(shù)（其中90%以上為2型糖尿?。┮泽@人的速度在迅速增長(zhǎng)，2003年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球有近2億糖尿病患者，估計(jì)到2025年這一數(shù)字將超過3億，其病死率在發(fā)達(dá)國(guó)家僅次于心血管疾病、惡性腫瘤，成為第三位的致死病因疾病。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，糖尿病患病的人數(shù)也呈現(xiàn)飛速增長(zhǎng)，根據(jù)《中國(guó)糖尿病防病指南》中的數(shù)據(jù)，2型糖尿病發(fā)病率1979年僅為1%，到2002年則迅速增長(zhǎng)至4%～5%。糖尿病特別是2型糖尿病目前已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類身心健康的主要公共衛(wèi)生問題，從而引起各國(guó)政府以及廣大醫(yī)務(wù)工作者的高度關(guān)注和重視，使得糖尿病發(fā)病機(jī)制研究以及治療藥物的探索一直是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

中醫(yī)藥防治糖尿?。ㄖ嗅t(yī)稱之為“消渴”，基本病機(jī)為陰虛燥熱）具有悠久的歷史，形成了系統(tǒng)的理論和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，歷代醫(yī)家總結(jié)出了大量有效驗(yàn)方。值得注意的是，通過文獻(xiàn)檢索對(duì)這些古今驗(yàn)方進(jìn)行比較分析，筆者發(fā)現(xiàn)大多含有黃連、生地二味中藥（其中生地還被譽(yù)為治療糖尿病四大“圣藥”之一），由此可見，黃連、生地配伍是迄今臨床上治療糖尿病最常用的藥對(duì)之一。黃連、生地配伍源自孫思邈《千金要方》，稱之為黃連丸，方中黃連清熱為君，生地滋陰為臣，共奏清熱滋陰之功效，主治消渴。由于“藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”，“七情合和”、“君臣佐使”等配伍理論是在歷代醫(yī)藥學(xué)家廣泛實(shí)踐的基礎(chǔ)上發(fā)展成熟的，黃連－生地藥對(duì)能如此久遠(yuǎn)地應(yīng)用于糖尿病的治療，提示其配伍應(yīng)有深刻的科學(xué)內(nèi)涵，也就是說黃連配伍生地治療糖尿病可能存在協(xié)同作用，本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ尾靜脈注射的方法，誘導(dǎo)雄性SD大鼠建立2型糖尿病動(dòng)物模型，觀察比較黃連、生地及其配伍對(duì)2型糖尿病大鼠的治療作用，以期進(jìn)一步揭示黃連丸方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵。

Reed等用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)雄性SD大鼠，成功建立與人類2型糖尿病相似的動(dòng)物模型［7］。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠5周誘導(dǎo)胰島素抵抗，聯(lián)合小劑量STZ選擇性破壞胰島β細(xì)胞的方法建立模型。本實(shí)驗(yàn)觀察到模型大鼠FBG顯著升高、INSAUC顯著減小、ISI顯著降低、血清TG、TC、LDL－C顯著升高，HDL－C顯著降低，與人類2型糖尿病特征相似。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黃連、生地及其配伍均能降低FBG、增加INSAUC、升高ISI、降低血清 TG、TC、LDLC，升高HDL－C，提示黃連、生地及其配伍均能降糖、調(diào)脂，而且黃連生地配伍作用明顯優(yōu)于各單藥，說明黃連配伍生地具有一定的協(xié)同性，初步揭示了黃連丸方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵。至于黃連、生地及其配伍治療2型糖尿病作用機(jī)制以及作用靶點(diǎn)上的選擇性或協(xié)同性有待進(jìn)一步研究。

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