補腎活血方對激素性股骨頭壞死大鼠BMSCs分化影響的研究＊

帥 波 沈 霖 楊艷萍 謝 晶 周丕琪 徐曉娟 李成剛 伍滿香

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合骨科，武漢 430022

股骨頭缺血性壞死（ischemic necrosis of the femoral head，INFH）是嚴重影響人類健康的重要疾病之一。INFH為現(xiàn)代醫(yī)學之名，屬于中醫(yī)的“骨蝕”、“骨痰”、“骨痹”、“血痹”、“骨痿”等范疇。INFH 的治療關鍵為骨的修復和血管新生，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療早期INFH方面體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。補腎活血方為青娥丸加味而成，具有“補肝腎、益氣血、生髓骨”的功效，在治療早期INFH方面取得良效。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，骨髓間充質(zhì)細胞（bone marrow stromal cells，BMSC）的分化及其調(diào)控在股骨頭缺血性壞死的預防和治療中起著重要的作用，其相關研究近年來成為熱點［1］。本實驗擬采用含藥血清干預的方法，探討補腎活血方對激素性INFH股骨近端骨髓間充質(zhì)細胞的成骨分化及轉(zhuǎn)化生長因子－β1（transforming growth factor beta－1，TGF－β1）mRNA 的影響，從細胞及分子學角度探討補腎活血方治療激素性INFH的機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

流式細胞儀（Becton－Dickinson，美國）、雙面超凈工作臺（國產(chǎn)）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Sheldon，美國）、倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）、紫外分光光度計（天津天光光學儀器有限公司）、LG－DMEM干粉培養(yǎng)基（Gibco，美國）、胎牛血清（Gibco，美國）、胰蛋白酶干粉（Sigma，美國）、堿性磷酸酶試劑盒（上海虹橋醫(yī)用試劑研究所）、β－甘油磷酸鈉（Sigma，美國）、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2（recombinant human bone morphogenetic protein－2，rhBMP－2）（R＆D公司，美國）。

1.2 補腎活血方制劑的制備

補腎活血方為古方青娥丸加味制作：取杜仲（鹽炒）960g，補骨脂（鹽炒）480g，核桃仁（炒）300g，丹參480g，蒸大蒜240g，飲片洗凈，置多功能提取器中，加5倍量水浸泡2h后，加熱煎煮2h，藥液過濾，藥渣再水煎煮2次，每次1h，合并3次藥液，濃縮至稠膏狀（100%），趁熱倒入3倍量95%乙醇中，邊加邊攪拌，靜置24h后過濾。濾液回收乙醇，濃縮至每ml相當于生藥2g，加1倍量蒸餾水，通過已轉(zhuǎn)成氫型并洗至中性的732型陽離子交換樹脂（用量為藥材重量的25%，V／W）柱，有效成分被吸附于樹脂上，然后用2%氫氧化鈉洗脫，用10%鹽酸調(diào)整pH至7，濃縮，4℃冰箱冷藏備用。

1.3 含藥血清的制備

根據(jù)李儀奎［2］方法，取40只雄性SD大鼠（購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心），隨機分為4組，每組10只。中藥組灌胃給藥，高濃度組給藥2.0 ml，中濃度組給藥1.0ml，低濃度組給藥0.5ml。每天1次，連續(xù)3d，在末次給藥2h后采血，分離血清，56℃滅活30min，過濾分裝，置－20℃冰箱備用。對照組按以上方法用生理鹽水1.0ml灌胃，制備普通血清。在實驗時，各組均采用終濃度為10%的不同血清。

1.4 BMSC的分離培養(yǎng)與鑒定

按李雄等［3］方法建立實驗用激素性INFH大鼠模型，8只雄性SD大鼠，用醋酸強的松龍49mg／kg臀肌注射，每天1次，連續(xù)注射6d后，于第7天處死，抽取4～5ml骨髓，置入裝有DMEM培養(yǎng)液的20ml無菌離心管中，以Percoll（密度為1.073g／ml）為分離介質(zhì)，用梯度離心法分離單個核細胞。多次洗滌后重新懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3～5d后換液，去除未貼壁的細胞，每3d換液1次，每天觀察細胞形態(tài)、貼壁及生長情況。待細胞融合達80%～90%，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。收集第3代BMSC，流式細胞儀分別檢測CD34、CD90、CD44和CD45等抗原的表達。

1.5 細胞分組培養(yǎng)

將空白對照血清（A組）、補腎活血方含藥血清低（B組）、中（C組）、高（D組）濃度分別置于培養(yǎng)孔中，每孔均含rhBMP－2，取第3代BMSC，調(diào)整細胞密度為1×105／ml，每組加200μl細胞懸液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 細胞數(shù)量檢測及細胞增殖測定

分別于培養(yǎng)第1、3、5、7、10、12和15天對四組細胞通過MTT法檢測細胞增殖活性。每孔加MTT溶液200μl，37℃孵育4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔內(nèi)加入1 000μl DMSO，振蕩10min裂解細胞，使結(jié)晶物充分融解，分光光度計于570nm波長處測定OD值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD570值為縱坐標繪制生長曲線。

1.7 ALP活性檢測

分別于培養(yǎng)的第5、10、15和20天，將各組培養(yǎng)的細胞用PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)基1ml終止消化，離心洗滌后，加細胞裂解液，然后按ALP檢測試劑盒說明進行加樣操作，用分光光度計于520nm波長處測定OD，然后計算出ALP含量。

1.8 TGF－β1mRNA的測定

TGF－β1引物：根據(jù)PCR引物設計原則，設計引物。TGF－β1引物為：fGTGCTCGCTTTGTACAACAGC，rTTACCAAGGTAACGCCAGG，擴增片段為336bp，β－actin 引物為：fTCACCCACACTGTGCCCATCTACGA，rTCACCCACACTGTGCCCATCTACGA，擴增片段為300bp。按試劑盒說明，用TRIzol提取細胞總RNA，進行RT－PCR擴增。PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃30s，60℃30s，72℃40s，30個循環(huán)，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物在1.5% 的瓊脂糖凝膠上電泳。紫外透射儀上檢測，凝膠成像儀攝像。求出每條目的條帶與β－actin條帶的比值，統(tǒng)計學處理。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行方差分析，結(jié)果以±s表示，同時應用LSD及Dunnett－t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的鑒定

流式細胞檢測結(jié)果顯示：BMSC細胞表面主要陰性標志物CD34和CD45均為陰性，陰性率分別為1.29%和2.51%，而BMSC細胞表面主要陽性標志CD44和CD90為陽性，陽性率分別為90.18%和92.63%，BMSC的濃度在90%以上。見圖1。

圖1 BMSC的鑒定圖

2.2 細胞生長觀察

倒置相差顯微鏡下觀察，隨時間的延長，A、B兩組細胞增加較C、D組緩慢，細胞數(shù)量相對較少，而C、D兩組中細胞在復合培養(yǎng)4h后可貼壁，呈現(xiàn)圓形或橢圓形；到第1天時，細胞生長分布均勻，呈長梭形；到第3天時，細胞數(shù)量增殖增多，呈多角形或梭形；到第5天以后，細胞數(shù)量持續(xù)增多，長滿瓶壁，呈單層生長，明顯優(yōu)于A、B兩組。見圖2。

圖2 BMSC培養(yǎng)10d時細胞黏附、增殖情況

2.3 細胞培養(yǎng)誘導的生長曲線

隨著培養(yǎng)誘導時間的延長，四組細胞數(shù)量均提高，A、B、C三組細胞數(shù)量在第10天時達到高峰，后入平臺期。而D組在第10天后細胞數(shù)量緩慢升高。A、B兩組細胞數(shù)量無明顯差異（P＞0.05），而C組及D組從培養(yǎng)的第5天開始細胞數(shù)量明顯高于A、B組（P均＜0.05）。見圖3。

圖3 細胞培養(yǎng)誘導生長曲線

2.4 細胞ALP活性檢測結(jié)果

隨培養(yǎng)誘導時間的延長，各組中細胞ALP活性均逐漸增高，第15天后，A、B組ALP活性逐漸趨緩，而C、D組仍逐漸增高，從第5天開始C、D組ALP活性明顯高于A、B組，第15天及第20天時，D組細胞的ALP活性明顯高于C組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 細胞ALP活性檢測

2.5 TGF－β1mRNA的表達情況

A組 TGF－β1mRNA相對表達量為（0.563±0.083），B 組為 （0.631±0.096），C 組 為 （3.197±0.636），D組為（2.463±0.501），A、B兩組表達量明顯減弱，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），C、D兩組TGF－β1mRNA相對表達量明顯高于A、B兩組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組TGF－β1mRNA表達

3 討論

INFH為現(xiàn)代醫(yī)學難治性疾病之一，古代醫(yī)家認為氣血對骨骼的滋養(yǎng)是骨骼維持正常形態(tài)和功能的關鍵。雖然歷代醫(yī)家對本病在病因病機的認識不盡相同，各有側(cè)重，但歸納起來不外乎腎虛、血瘀、痰濕等。治以補肝腎、益氣血、生髓骨、活瘀血、祛痰濕、止痹痛，使瘀凝祛而疼痛止，脈絡通而骨得養(yǎng)。INFH患者因腎虛或血瘀，導致骨枯髓減，骨髓功能下降，繼而分化為成骨細胞的能力及其活性也隨之下降，導致股骨頭局部骨壞死及再修復新生障礙。青娥丸加味是根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”原理，在傳統(tǒng)補腎中藥方青娥丸基礎上，加用活血中藥丹參，結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論及經(jīng)驗，從整體上調(diào)理肝腎，調(diào)節(jié)骨代謝，促進骨形成及骨組織的修復，預防INFH進一步發(fā)展。

骨髓間充質(zhì)細胞可以向成骨細胞、成纖維細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞等多個方向分化，故骨髓間充質(zhì)細胞中只有一部分是能自發(fā)分化為成骨細胞系的骨祖細胞，其在體外的分化很大程度上依賴于培養(yǎng)條件。故摸索MSC最佳體外培養(yǎng)條件使MSC多量、穩(wěn)定地向成骨細胞系分化，對骨組織的形成具有重要意義，一直以來是治療早期INFH良好的種子細胞［4］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一種存在于骨基質(zhì)中的糖蛋白多肽，含有二硫鍵結(jié)構，相對分子質(zhì)量18 000～30 000，除BMP1外構成了一個結(jié)構和功能相似的多肽因子家族［5］。BMPs能在生物體內(nèi)誘導未分化的間充質(zhì)細胞分化成為軟骨和骨。BMPs各成員的誘導成骨能力不同，其中以BMP－2的成骨能力最強，是骨組織形成過程中最為關鍵的調(diào)節(jié)因子之一，可誘導人或動物間充質(zhì)細胞分化為骨或軟骨組織，因此目前被廣泛研究，中醫(yī)藥干預運用也發(fā)揮著重要的作用［6］。

本文的結(jié)果顯示，rhBMP－2能夠誘導激素性INFH大鼠股骨近端分化中的 MSC表達TGF－β1mRNA，且一定濃度的補腎活血方含藥血清能夠促進這種作用，其中中、高濃度可達本組的最大效應。TGF－β1廣泛存在于正常組織中，尤其以骨組織中含量最為豐富。大量研究表明，TGF－β對骨質(zhì)再生起關鍵作用。TGF－β參與胚胎骨的形成和生長，在骨形成的早期，新生的軟骨內(nèi)和骨膜中分別有TGF－β1和TGF－β2的表達。TGF－β1能促進骨膜間充質(zhì)細胞增殖分化及骨細胞增殖，在骨系細胞中主要表現(xiàn)為促進間質(zhì)來源的細胞DNA合成及增殖，可明顯促進細胞外基質(zhì)的合成，刺激膠原、骨連接素和骨橋蛋白合成，增加骨基質(zhì)沉積率。TGF－β1還能增加成骨細胞定向遷移的能力，這在骨修復過程中吸收成骨祖細胞向激活的骨吸收部位移動，有重要的趨化作用［7］。筆者的前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，TGF－β1主要在成骨細胞的胞膜和胞質(zhì)內(nèi)表達，體內(nèi)研究表明中藥補腎方能明顯提高成骨細胞TGF－β1的表達。筆者的研究還顯示青娥丸能夠提高骨質(zhì)疏松癥患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶－2、骨堿性磷酸酶、骨鈣素，Ⅰ型膠原交聯(lián)C端肽和尿Ⅰ型膠原交聯(lián)N端肽水平，從而間接反映青娥丸能夠有效增強成骨細胞活性，促進骨形成抑制骨吸收，增強骨質(zhì)骨量［9］。本研究結(jié)果顯示一定濃度的補腎活血方含藥血清能夠促進分化中的MSC分泌ALP，通過對MSC形態(tài)學觀察、ALP活性測定等，均可說明經(jīng)傳代培養(yǎng)的細胞已經(jīng)具有與成骨細胞相似的形態(tài)及生長特點。但補腎活血方的作用機制是通過增強rhBMP－2活性還是直接作用于靶細胞需要進一步的觀察。

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