葛根素水溶液對(duì)酒精性腦病的藥理作用

鞠文博 曲智威 周 艷 (北華大學(xué)組胚教研室，吉林 吉林 3203)

酒精中毒可導(dǎo)致機(jī)體很多器官發(fā)生病變，亦可以導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以四肢及舌震顫、癲樣發(fā)作、共濟(jì)失調(diào)居多〔1〕。長(zhǎng)期大量飲酒可帶來(lái)大腦結(jié)構(gòu)持久性或可逆性改變，有人對(duì)酒精成癮者尸檢發(fā)現(xiàn)，有半數(shù)以上的病人合并有腦萎縮和神經(jīng)細(xì)胞變性、脫髓鞘及膠質(zhì)細(xì)胞增生〔2〕。因此，酗酒和酒精中毒對(duì)大腦的損害成為世界性的研究課題〔3〕。葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取的一種化學(xué)成分，其化學(xué)名為8-β-D葡萄吡喃糖-4，7二羥基異黃酮〔4〕。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，葛根素具有降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量〔5〕;對(duì)心肌的保護(hù)作用，對(duì)腎的保護(hù)作用，抗氧化作用，抗缺血再灌注損傷的作用〔6〕;抗酒精中樞抑制作用，降血糖，防治糖尿病及其并發(fā)癥，改善血液流變學(xué)指標(biāo)，改善微循環(huán)和抗血小板聚集等作用〔7〕。本課題組選用了葛根素作為對(duì)抗酒精的中藥進(jìn)行試驗(yàn)研究，從中醫(yī)中藥角度治療酒精性腦病提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 30只Wistar大鼠，雄性，體重 (180±20)g(由吉林大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所提供)，50%葡萄糖，葛根素，酒精，顯微攝像系統(tǒng) (Olympus)，離心機(jī)，組織勻漿機(jī);腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒 (由深圳晶美生物工程有限公司提供);全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國(guó)BIO-TEK 800型);鱟試劑盒 (北京中山生物技術(shù)有限公司)。兔抗鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2)多克隆抗體 (美國(guó)Cayman公司);小鼠抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白 (β-actin)單克隆抗體 (美國(guó)Sigma公司);生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗 (英國(guó)KPL公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔及羊抗鼠二抗、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑 (ECL，北京中山生物技術(shù)有限公司)，硝酸纖維素膜 (北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法 動(dòng)物分組：30只Wistar大鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只。對(duì)照組用50%葡萄糖20 ml·kg－1·d－1灌胃，模型組用40%酒精按 8 g·kg－1·d－1灌胃，葛根素組：葛根素水溶液10 mg·kg－1·d－1灌胃給藥5 min后，酒精灌胃，酒精量同模型組。給藥30 d造模結(jié)束后，采用巴比妥鈉麻醉、腹主動(dòng)脈采血后處死大鼠。

1.3 內(nèi)皮素(ET)檢測(cè) 用偶氮顯色法定量檢測(cè)和葛根素組大鼠血漿中的ET水平(依據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè))。

1.4 腦組織TNF-α檢測(cè) 抽血后，斷頸處死各組大鼠，在無(wú)菌條件下，剖開(kāi)顱腦，切取大腦組織，生理鹽水洗凈備用。取一小塊大腦組織稱取濕重后，按W∶V為1∶5的比例加入生理鹽水，用組織勻漿機(jī)攪拌成腦勻漿。將勻漿置于離心管中，以4 000 r/min離心20 min，取上清液，用ELISA法檢測(cè)各組腦組織勻漿中TNF-α的含量(依據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè))。

1.5 COX-2表達(dá)檢測(cè) 使用Western印跡方法檢測(cè)腦組織COX-2表達(dá)。取冷凍的腦組織稱重后按1∶10比例用三去污蛋白裂解液裂解，10 000 r/min離心5 min，2次，取上清。用考馬斯亮藍(lán)(G250)測(cè)定蛋白含量。以每樣品總蛋白為150 μg上樣，用不連續(xù)10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜：10%脫脂奶粉封閉;一抗4℃過(guò)夜;Ris緩沖液(TBS)洗膜;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗37℃2 h，TBS洗膜，ECL作用后X膠片曝光，經(jīng)顯影、定影等處理后觀察結(jié)果。并用Bandscan軟件作灰度掃描分析，用COX-2與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示各樣本COX-2表達(dá)強(qiáng)度，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以s表示，采用T檢驗(yàn)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對(duì)照組被毛光滑，精神狀態(tài)好，食欲佳，體重增加。模型組的大鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，食欲減退，消瘦，皮毛無(wú)光澤，有脫毛現(xiàn)象，體重較前有所下降。葛根素組的大鼠精神、食欲及活動(dòng)和對(duì)照組無(wú)明顯差異。

2.2 血漿中ET的含量 模型組血漿中ET含量明顯高于對(duì)照組和葛根素組，葛根素組和對(duì)照組無(wú)差異。見(jiàn)表1。

2.3 腦組織勻漿中TNF-α含量 模型組的腦組織勻漿中TNF-α的含量明顯高于對(duì)照組，葛根素組和對(duì)照組差異不顯著。見(jiàn)表1。

表1 葛根素組和對(duì)照組及模型組的大鼠血漿中ET含量和腦組織勻漿中TNF-α含量比較(s)

表1 葛根素組和對(duì)照組及模型組的大鼠血漿中ET含量和腦組織勻漿中TNF-α含量比較(s)

與模型組比較：1)P＜0.05

組別 n ET(Eu/ml)TNF-α(ng/g)對(duì)照組 10 0.302±0.078 10.73±0.361)葛根素組 10 0.503±0.128 12.73±0.381)模型組 10 0.812±0.126 16.68±0.432)

2.4 腦組織COX-2表達(dá) 對(duì)照組呈弱表達(dá)，模型組顯著高表達(dá)，與對(duì)照組比較差別顯著(P＜0.01)。葛根素組COX-2表達(dá)下調(diào)，與模型組相比有明顯下調(diào)(P＜0.01)。經(jīng)計(jì)算機(jī)Bandscan軟件分析其灰度值，COX-2灰度值與β-actin灰度值比值為：對(duì)照組為0.196±0.079，模型組為0.421±0.033，葛根素組為0.281±0.046。見(jiàn)圖1。

圖1 腦組織COX-2表達(dá)結(jié)果

3 討論

長(zhǎng)期大量飲酒帶來(lái)的損傷是廣泛的，包括消化系統(tǒng)的潰瘍、嚴(yán)重的肝臟的損害、腎臟的損駭以及循環(huán)系統(tǒng)的損害等多器官、多系統(tǒng)的損害，更加嚴(yán)重的是神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，表現(xiàn)為一系列思維及行為釋放狀態(tài)，如患者理智障礙、易沖動(dòng)、共濟(jì)失調(diào)、語(yǔ)無(wú)倫次、嘔吐、嗜睡等，因大腦急性缺氧，重者可引起癲癇、抽搐甚至死亡。酒精性肝損傷與ET血癥具有相關(guān)性，原因可能是飲酒后，一方面造成腸道菌群失調(diào)，革蘭陰性菌產(chǎn)生增多，腸源性ET增多;另一方面，酒精可致腸壁通透性增加，進(jìn)而ET吸收入血增加，導(dǎo)致腸源性ET血癥;而ET可直接引起血腦屏障通透性增加，誘使腦微血管出現(xiàn)凝血功能紊亂，造成腦組織缺氧，以及誘導(dǎo)腦組織中TNF-α的升高，從而使腦組織發(fā)生炎性水腫〔8〕。ET致細(xì)胞因子在大鼠腦水腫中表達(dá)增加已有研究證實(shí)〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是使血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)上調(diào)的重要細(xì)胞因子，能夠引起白細(xì)胞趨化，破壞血腦屏障，興奮氨基酸受體，并刺激膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，從而造成腦水腫〔10〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明葛根素能夠?qū)咕凭珜?duì)大鼠腦組織損傷的影響，其機(jī)制可能是在急性酒精中毒的情況下，葛根素可以改善血液循環(huán)，增加組織氧供，有利于酒精的氧化代謝;通過(guò)擴(kuò)張血管，改善腎小管的痙攣狀態(tài)而增加腎血流量，尿量增加，排泄增強(qiáng)，從而降低血液中乙醇水平，減少腸道對(duì)酒精的吸收，從而減少血液中含ET量的增高，減少腦組織炎性因子TNF-α的增加，從而減少腦組織發(fā)生炎性水腫，降低對(duì)腦組織的損傷。

COX是前列腺素類(PGs)物質(zhì)合成過(guò)程中的一個(gè)限速酶。COX-2亞型在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，但在炎癥、腫瘤等病理狀態(tài)下，可受眾多因素的刺激，其表達(dá)明顯升高〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：葛根素組COX-2表達(dá)與模型組相比有明顯下調(diào)。

本項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，葛根素具有減少機(jī)體對(duì)酒精的吸收，減輕酒精對(duì)腦組織的損傷作用，其作用機(jī)制主要是減少ET的吸收，從而減少腦組織中TNF-α及COX-2含量，減輕了對(duì)腦組織的損傷。

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