潑尼松龍對脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NO、iNOS及p38表達(dá)的影響

王 丹 徐德軍 樸花子 (延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 33002)

小膠質(zhì)細(xì)胞在老年性癡呆、帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中有重要作用〔1～4〕，是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的一類重要免疫效應(yīng)細(xì)胞，在維持神經(jīng)元生存和生命活動中起著重要作用，它具有免疫和炎癥的雙向調(diào)節(jié)功能。脂多糖(LPS)即內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌的主要致病成分，當(dāng)LPS攻擊巨噬細(xì)胞時，可激活巨噬細(xì)胞內(nèi)p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路，促使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等表達(dá)增加，產(chǎn)生大量NO，參與炎癥反應(yīng)。潑尼松龍是中效腎上腺皮質(zhì)激素藥，屬于甾體類抗炎藥。對多種原因所致的炎癥反應(yīng)(如感染性炎癥、物理性炎癥、化學(xué)性炎癥、免疫性炎癥及無菌性炎癥)均有效，所以臨床上廣泛應(yīng)用于各種原因所致的過度炎癥性疾病，如過敏性疾病、嚴(yán)重細(xì)菌感染、腫瘤治療、器官移植免疫排斥反應(yīng)及對糖皮質(zhì)激素敏感的眼部炎癥等。BV2細(xì)胞屬于小膠質(zhì)細(xì)胞株，本實(shí)驗(yàn)觀察p38 MAPK信號通路在潑尼松龍干預(yù)后NO、磷酸化p38(p-p38)及iNOS蛋白表達(dá)變化和iNOS mRNA表達(dá)變化中的調(diào)控作用，來探討其在LPS所致的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 潑尼松龍與LPS均為美國Sigma公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)和TRIZOL試劑為美國 Gibco公司產(chǎn)品。p38 MAPK、P-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、iNOS 抗體為 Santa Cruz公司產(chǎn)品，小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株由韓國梨花女子大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)培養(yǎng)，37℃，5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，細(xì)胞單層生長，達(dá)80%左右時傳代。細(xì)胞接種到培養(yǎng)板后均孵育過夜，潑尼松龍在LPS使用前1 h加入。

1.3 分組與處理 細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板(3.5×105細(xì)胞/ml，0.2 ml/孔)12 h后實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、LPS(100 μg/L)組、潑尼松龍(10、20、30 μmol/L)組和 LPS 加潑尼松龍組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，Greiss法測定培養(yǎng)液中NO含量。

1.4 iNOS mRNA測定 細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿(2×106細(xì)胞/ml)中培養(yǎng)12 h后，分別添加潑尼松龍 (10 μmol/L)和LPS(500 μg/L)。繼續(xù)培養(yǎng)6 h，按說明書用Trizol試劑抽提RNA，計算總RNA濃度，取總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。再以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2 μl作為模板，加入相應(yīng)引物(β-actin內(nèi)參照)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體積50 μl。所用iNOS引物序列上游引物5'-TCA CTG GGA CAG CAC AGA ATG-3'，下游引物 5'-AAC TGG GTG AAC TCC AAG GT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物684 bp;β-actin上游引物5'-TGA ACC CTA AGG CCA ACC-3'，下游引物5'-CCA CAG GAT TCC ATA CCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物489 bp。PCR條件為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 45 s，53℃復(fù)性 45 s，72℃延伸 45 s，30 個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，Quantity One軟件分析二者PCR產(chǎn)物光密度值，以目的mRNA與內(nèi)參β-actin的RT-PCR產(chǎn)物光密度比值作為目的mRNA相對表達(dá)量。

1.5 Western印跡法測定BV2細(xì)胞iNOS和p-p38蛋白表達(dá)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(9×105細(xì)胞/ml)，分別添加潑尼松龍(10 μmol/L)和 LPS(500 μg/L)。細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，用冰冷的PBS終止刺激并洗滌細(xì)胞2次，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下，按說明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠和10%分離膠)、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別添加抗iNOS、P-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK/JNK 和(或)抗 β-actin一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜、加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶2 000)，37℃下孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，用圖像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)帶光密度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白光密度比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 潑尼松龍對LPS誘導(dǎo)NO含量的影響 細(xì)胞培養(yǎng)液中添加 LPS(100 μg/L)和潑尼松龍(0.1、1、10 μmol/L)處理細(xì)胞后培養(yǎng)24 h。LPS組與空白對照組比較，NO含量高達(dá)404%，而潑尼松龍可明顯抑制由LPS誘導(dǎo)NO分泌，各劑量潑尼松龍組NO含量分別為292%、176%、115%，有劑量依賴性，潑尼松龍1、10 μmol/L組與LPS組比較差異顯著(P＜0.05)。

2.2 潑尼松龍對LPS誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)影響 無LPS刺激情況下BV2細(xì)胞不表達(dá)iNOS基因，同時單純潑尼松龍對iNOS表達(dá)無影響。但是用LPS刺激后，BV2細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高，而潑尼松龍明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白表達(dá)，而且明顯低于單獨(dú)使用LPS組(圖1)。

2.3 潑尼松龍對LPS誘導(dǎo)的P-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK蛋白表達(dá)的影響 用LPS刺激后，BV2細(xì)胞P-p38和p-ERK1/2表達(dá)顯著增高，而潑尼松龍明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞P-p38的表達(dá)，而對p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK表達(dá)沒有明顯影響(圖2)。

圖1 潑尼松龍對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的iNOS mRNA(A)和iNOS蛋白(B)表達(dá)的影響

圖2 潑尼松龍對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞P-p38/p38、p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK蛋白表達(dá)的影響

3 討論

某些病理條件下，如感染、外傷、缺血、毒性物質(zhì)侵害等情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞可被激活，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)充當(dāng)?shù)谝坏婪谰€，調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)的某些分子表達(dá)，釋放細(xì)胞因子和趨化因子等，同時發(fā)揮機(jī)械吞噬功能，吞噬入侵的病原體、有害物質(zhì)及死亡的神經(jīng)細(xì)胞殘骸核，對神經(jīng)元起到一定保護(hù)作用;而另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞長期持續(xù)活化，會分泌一系列毒性物質(zhì)和前炎性因子，如氧自由基、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、NO等。這些物質(zhì)與小膠質(zhì)細(xì)胞活化互為因果，相互作用，使CNS炎癥反應(yīng)放大、毒性產(chǎn)物進(jìn)一步增多，導(dǎo)致相應(yīng)腦區(qū)神經(jīng)元變性壞死，從而引起相應(yīng)疾病。目前，已經(jīng)公認(rèn)的是某些神經(jīng)退行性疾病發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，例如阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化和創(chuàng)傷后腦缺血損傷等疾病都與炎癥相關(guān)。持續(xù)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量 NO、TNF-α、IL-β、自由基等致炎因子和細(xì)胞毒性因子，從而引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，這種炎癥反應(yīng)是神經(jīng)變性疾病發(fā)展中的早期主要事件，并且過量生成、積聚的炎癥因子與神經(jīng)細(xì)胞死亡也有關(guān)。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活可能是抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵所在。本研究首次證明了潑尼松龍通過MAPK信號通路抑制LPS激活的BV2細(xì)胞中NO/iNOS表達(dá)。

NO是一種具有高反應(yīng)活性的小分子活性物質(zhì)，在多種生理條件下及病理活動中發(fā)揮重要作用。正常情況下NO是一種細(xì)胞內(nèi)信使分子，對機(jī)體發(fā)揮著有益的調(diào)節(jié)作用，但當(dāng)炎癥發(fā)生時，會使iNOS表達(dá)增高并合成過量的NO，此時NO起細(xì)胞毒素分子的作用。LPS是刺激小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)iNOS的最有效刺激物之一，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞正是通過iNOS過表達(dá)而合成過量的NO，從而造成神經(jīng)元細(xì)胞損傷。有研究報道LPS能高度激活小膠質(zhì)細(xì)胞，并產(chǎn)生 NO、TNF-α、IL-β、自由基及類花生酸類等致炎物質(zhì)，從而引起神經(jīng)元損傷〔5，6〕。

MAPK是真核細(xì)胞中絲氨酸/蘇氨酸激酶，可激活其他蛋白激酶，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性。MAPK家族包括p38MAPK、ERK和JNK等重要成員。其中多位學(xué)者已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)p38MAPK參與調(diào)控LPS誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)和NO的產(chǎn)生〔7〕。其中p38MAPK信號通路已被證實(shí)是控制炎癥反應(yīng)的最重要成員之一，p38蛋白磷酸化是確保此通路活化和執(zhí)行轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的必要條件〔8〕。

潑尼松龍是中效腎上腺皮質(zhì)激素藥，屬于甾體類抗炎藥。臨床上廣泛應(yīng)用于各種原因所致的過度的炎癥性疾病，如過敏性疾病、嚴(yán)重細(xì)菌感染、腫瘤治療、器官移植免疫排斥反應(yīng)及對糖皮質(zhì)激素敏感的眼部炎癥等。白宇等〔9〕報道，甲潑尼龍對急性腦衰竭有顯著治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，潑尼松龍可能通過抑制p-p38MAPK活化途徑下調(diào)iNOS表達(dá)和NO產(chǎn)生，從而起抗LPS作用。由于LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路復(fù)雜，涉及信號分子眾多，因而明確潑尼松龍抗LPS機(jī)制尚需深入研究。

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