血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的微小RNA調(diào)控及其在冠心病治療中的應(yīng)用

郭威早 佟 倩 (航天中心醫(yī)院高干二科，北京 00049)

冠心病是我國居民死因構(gòu)成中上升最快的疾病〔1〕。遺傳易感性是冠心病發(fā)病的重要因素，然而目前對冠心病的致病基因及其作用機制仍然沒有定論〔2〕。在冠心病眾多的候選基因中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是被研究得最為深入和廣泛的發(fā)病相關(guān)基因之一〔3〕。但是，關(guān)于ACE的研究結(jié)果在不同的人群中不盡相同。既往的研究也提示基因-基因以及基因-環(huán)境相互作用是一個值得深入的研究方向〔4〕。微小RNA(microRNA，miRNA)是生物體中內(nèi)源性的由基因表達產(chǎn)生的短鏈RNA分子，長度為22個核苷酸左右，通過與相關(guān)的信使RNA(mRNA)結(jié)合抑制其翻譯或誘發(fā)其降解〔5〕。miRNA通過基因調(diào)控，在細胞的生長、發(fā)育、分化以及對環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用〔6〕。如果將miRNA機制納入ACE的基因調(diào)控，則可以合理地建立基因與環(huán)境的相互作用，更好地符合冠心病的宏觀模型。基于上述背景，本研究對ACE的miRNA調(diào)控機制進行探討和分析。

1 材料與方法

1.1 調(diào)節(jié)ACE基因的miRNA預(yù)測 根據(jù)“種”序列匹配原理，利用美國麻省理工學院(MIT)TargetScan數(shù)據(jù)庫(2011年11月第6版)進行，對人ACE基因1 014 bp(根據(jù)NCBI編號為NM_152830參考序列)的3'-UTR進行了候選miRNA的預(yù)測。具體操作方法根據(jù)該數(shù)據(jù)庫的在線操作指南進行。

1.2 大鼠心肌細胞培養(yǎng) 大鼠心肌細胞株H9c2(2-1)購自美國ATCC公司，在Forma-3110型二氧化碳溫箱中，參照本課題組此前報道的方法〔7〕進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Invitrogen公司?；静襟E：采用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。每輪培養(yǎng)3 d。階段培養(yǎng)結(jié)束后，采用0.25% 胰蛋白酶合并0.53 mmol/L EDTA溶液處理10 min，細胞脫壁收集后按1∶4的比例分盤繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 miRNA的增強和抑制 增強劑和抑制劑均從美國ABI公司購買。miR-27a/27b增強劑為合成的雙鏈RNA分子;miR-27a/27b抑制劑為化學修飾的單鏈核酸，可以特異地結(jié)合miR-27a/27b而產(chǎn)生抑制效應(yīng)。此外，以Pre-miR(增強)/Anti-miR(抑制)陰性對照1號作為陰性對照。為了將miR-27a/27b增強劑、抑制劑及陰性對照導(dǎo)入培養(yǎng)的H9c2(2-1)大鼠心肌細胞，實驗采用美國Neuromics公司iFect轉(zhuǎn)染試劑盒，具體操作按照該試劑盒說明書進行。每種miRNA轉(zhuǎn)染劑量在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，按有效最低劑量原則選擇為20 nmol/L。細胞在轉(zhuǎn)染后狀態(tài)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 蛋白免疫印跡雜交 參照文獻報道〔7〕方法進行，作了少許簡化和修改。具體步驟：將收集的約106個心肌細胞在1 ml冰冷的裂解緩沖液中重懸，細胞裂解緩沖液購自北京博大萬興科技有限公司。勻漿后通過Virtis超聲細胞粉碎儀進行超聲剪切(設(shè)置2.0，處理1 s×10次);然后，以Eppendorf-5417R離心機于4℃，12 000 r/min，離心5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進行。等量的蛋白加入到8%～16%SDS-PAGE進行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結(jié)合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水，0.1%吐溫-20，5%脫脂牛奶。兔抗人ACE抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，該抗體除可用于人源性ACE蛋白的檢測，亦可以用于大鼠和小鼠ACE蛋白的檢測。實驗中采用1∶200的比例稀釋。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯(lián)的抗兔抗體，購自北京翰譜生物醫(yī)藥研究所。免疫復(fù)合物用Amersham ECL加強型試劑盒檢測。免疫印跡的定量分析采用Syngene凝膠建檔及分析系統(tǒng)進行。

1.5 統(tǒng)計學分析 一元ANOVA采用SPSS11.5軟件進行。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)節(jié)人ACE基因的miRNA預(yù)測結(jié)果 共有218個miRNA具有和人類ACE基因3'-UTR結(jié)合并調(diào)節(jié)該基因的理論可能性。在ACE基因與心血管疾病關(guān)系的研究中，許多疾病模型均建立于動物如大鼠〔8〕，這種研究的前提就是大鼠和人在ACE基因調(diào)控方面具有基本的一致性。依照這個前提，本研究對miRNA的種系恒定性(conservation)進行了進一步的分析，采用兩個種系恒定性的標準，即miRNA自身的種系恒定性以及在ACE上所預(yù)測的結(jié)合位點的種系恒定性，兩種恒定性的標準均采用MIT所開發(fā)的TargetScan數(shù)據(jù)庫第6版的相關(guān)標準。具體的分析及分類結(jié)果見表1。

表1 ACE基因3'-UTR候選miRNA的種系恒定性

根據(jù)表1的結(jié)果，miR-27a和miR-27b兩個miRNA自身具有廣泛的種系恒定性(從靈長類到魚類都存在)，且在ACE基因的結(jié)合位點上也具有種系恒定性(由進化樹推導(dǎo))，因此被作為候選miRNA，進行進一步的實驗驗證。

2.2 miR-27a/miR-27b的增強和抑制對ACE蛋白表達水平的影響 圖1可見，與預(yù)計完全一致，使用相應(yīng)的前體對miR-27a和miR-27b進行功能增強顯著地減低了ACE的蛋白水平，而使用相應(yīng)的抑制劑對miR-27a和miR-27b進行抑制則顯著地增加了ACE的蛋白水平。以miR-27a和miR-27b前體處理心肌細胞48 h后分別使ACE蛋白水平降低了30.32%(P=0.027)和36.35%(P=0.008);同時，以miR-27a和miR-27b抑制劑處理心肌細胞48 h分別導(dǎo)致ACE蛋白水平提高了42.06%(P=0.026)和65.39%(P=0.001)。在調(diào)節(jié)ACE蛋白水平方面，miRNA-27a和miR-27b二者之間無顯著性差異，無論是在其功能增強(P=0.834)還是在其功能抑制(P=0.280)的狀態(tài)下。

圖1 在miR-27a和miR-27b功能增強和功能抑制的情況下，ACE蛋白表達水平的變化

3 討論

冠心病與眾多的基因具有相關(guān)性〔9〕，而其中相當一部分基因又有很多的miRNA參與調(diào)節(jié)〔10〕，因此這一領(lǐng)域的研究產(chǎn)生了較多的盲目性，需要一種研究手段對眾多的因素進行進一步的甄別和比較，以便使后續(xù)研究更具有針對性。本文采用了一個比較新穎的策略，就是一個基因的種系穩(wěn)定性，也就是所謂的保守性越好，則該基因具備的功能性可能就越基礎(chǔ)、越重要，這一策略借鑒了基因進化的某些研究成果〔11〕。

本文選取了冠心病中一個極為重要的候選基因—ACE基因，對可能參與其調(diào)節(jié)的miRNA進行了預(yù)測，預(yù)測的依據(jù)是miRNA“種子區(qū)”(seed region)學說，這一學說多次被國際一流研究雜志報道，也獲得學術(shù)界較為廣泛的認同。由于miRNA和被調(diào)節(jié)基因之間沒有特定的、嚴格的對應(yīng)關(guān)系，具有“一對多、多對一”的特點，直接的實驗驗證難度和成本巨大，因此對調(diào)節(jié)特定基因的miRNA進行預(yù)測尤為必要。本研究的預(yù)測依據(jù)一種組合策略〔12〕，這一策略有兩個候選條件：(1)從miRNA 5'端第一或第二堿基算起的7個連續(xù)堿基的“核”序列或“種子”序列與被調(diào)節(jié)基因3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)部分序列構(gòu)成完全Watson-Crick匹配(即符合堿基配對原則的匹配);(2)上述“核”序列和3'-UTR對應(yīng)序列之間可以具有不匹配的堿基，只要兩者結(jié)合的自由能不增加并且不含G∶U配對。一個miRNA只要與某一基因具備上述情形之一，則可以認為該miRNA具有調(diào)節(jié)該基因的可能。預(yù)測的結(jié)果顯示，200多個miRNA可能對ACE基因具有調(diào)節(jié)作用，根據(jù)miRNA自身的種系穩(wěn)定性以及在人類ACE基因3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)所預(yù)測的結(jié)合位點的種系穩(wěn)定性，最后確認miR-27a和miR-27b是最有可能對ACE基因產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的候選miRNA。利用大鼠心肌細胞，在對miR-27a和miR-27b進行增強和抑制的同時，本文觀察了ACE基因編碼的蛋白表達水平的變化。與理論預(yù)計一致，在miR-27a和miR-27b被增強時，ACE的表達水平明顯降低;而在miR-27a和miR-27b被抑制時，ACE的表達水平則明顯升高。

目前，有許多ACE抑制劑用于高血壓的治療，研究顯示ACE抑制劑在冠心病治療中的前景也是令人矚目的〔13〕。從機制而言，miR-27a和miR-27b可以通過抑制ACE基因表達從而作為內(nèi)源性的ACE抑制劑，其作用可以模擬ACE抑制劑的藥理作用。更重要的是，miRNA是機體自身的生理產(chǎn)物，沒有副作用，所以這一研究值得深入。

1 吳錫桂.我國人群冠心病流行現(xiàn)況與趨勢〔J〕.中國慢性病預(yù)防與控制，2003;11(4)：190-2.

2 Zintzaras E，Kitsios G.Identification of chromosomal regions linked to premature myocardial infarction：a meta-analysis of whole-genome searches〔J〕.J Hum Genet，2006;51(11)：1015-21.

3 Bonnici F，Keavney B，Collins R，et al.Angiotensin converting enzyme insertion or deletion polymorphism and coronary restenosis：meta-analysis of 16 studies〔J〕.BMJ，2002;325(7363)：517-20.

4 Agema WR，Jukema JW，Zwinderman AH，et al.A meta-analysis of the angiotensin-converting enzyme gene polymorphism and restenosis after percutaneous transluminal coronary revascularization：evidence for publication bias〔J〕.Am Heart J，2002;144(5)：760-8.

5 Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004;116(2)：281-97.

6 Hatfield SD，Shcherbata HR，F(xiàn)ischer KA，et al.Stem cell division is regulated by the microRNA pathway〔J〕.Nature，2005;435(7044)：974-8.

7 郭威早，佟 倩，曹立新，等.微小RNA對心肌細胞C反應(yīng)蛋白功能水平的調(diào)節(jié)〔J〕.中國實驗診斷學，2010;14(12)：1900-3.

8 Kim S，Yoshiyama M，Izumi Y，et al.Effects of combination of ACE inhibitor and angiotensin receptor blocker on cardiac remodeling，cardiac function，and survival in rat heart failure〔J〕.Circulation，2001;103(1)：148-54.

9 Humphries SE，Cooper JA，Talmud PJ，et al.Candidate gene genotypes，along with conventional risk factor assessment，improve estimation of coronary heart disease risk in healthy UK men〔J〕.Clin Chem，2007;53(1)：8-16.

10 Rajewsky N.MicroRNA target predictions in animals〔J〕.Nat Genet，2006;38 Suppl：S8-13.

11 Dermitzakis ET，Clark AG.Evolution of transcription factor binding sites in Mammalian gene regulatory regions：conservation and turnover〔J〕.Mol Biol Evol，2002;19(7)：1114-21.

12 Krek A，Grun D，Poy MN，et al.Combinatorial microRNA target predictions〔J〕.Nat Genet，2005;37(5)：495-500.

13 Liu X，Lukasova M，Zubakova R，et al.Kallidin-like peptide mediates the cardioprotective effect of the ACE inhibitor captopril against ischaemic reperfusion injury of rat heart〔J〕.Br J Pharmacol，2006;148(6)：825-32.