半合成-酶連法克隆EFsec基因及其初步表達(dá)分析

李 麗 朱貴明 汪坤福 張鵬霞 (佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

硒蛋白(selenoprotein)是一類含有硒代半胱氨酸(selenocysteine，Sec)的特殊蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種生物中。在哺乳動(dòng)物中，硒蛋白不僅是硒的主要存在形式，也是主要的生物學(xué)功能形式。硒蛋白在抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等方面都有顯著的作用〔1～3〕，硒蛋白尤其是哺乳動(dòng)物硒蛋白的生物合成機(jī)制十分復(fù)雜，因?yàn)镾ec的編碼密碼子(UGA)就是正常情況下的終止密碼子，其解碼需要一系列復(fù)雜的反式作用因子以及順式作用元件的相互作用才得以完成;而且，硒蛋白的翻譯效率很低〔4，5〕。Efsec，即真核硒代半胱氨酸-tRNA 特異性延伸因子是其中一個(gè)重要的反式作用因子，推測(cè)其在細(xì)胞質(zhì)中先與硒代半胱氨酸-tRNA結(jié)合，因?yàn)镋fsec具有核定位序列(NLS)，故能夠攜帶硒代半胱氨酸-tRNA進(jìn)入細(xì)胞核，然后再與其他反式作用因子共同作用，將硒蛋白中編碼硒代半胱氨酸的密碼子UGA進(jìn)行解碼〔6～8〕。為了深入研究Efsec在UGA解碼中的作用以及提高硒蛋白的基因工程表達(dá)效率，本文采用酶連-半合成法克隆EFsec基因并將其連入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1，然后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T進(jìn)行初步表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌 TOP10、HEK293T細(xì)胞和質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)為本實(shí)驗(yàn)室所保存。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Pfu高保真酶、RT-PCR試劑盒等均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等均購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、血清、培養(yǎng)皿等為Hyclone產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Efsec基因的拼接策略和設(shè)計(jì) 質(zhì)粒pOTB7-EFsec為本實(shí)驗(yàn)保存。質(zhì)粒中插入目的基因EFsec來源于人的cDNA(GenBank ACCESSION No.BC007933)，克隆位點(diǎn)為EcoR I和Xho I。但該基因在5'端缺失一小段編碼的堿基序列，約90 bp，需要補(bǔ)齊才具有正常的功能。經(jīng)過酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，在該基因的5'端存在一個(gè)天然酶切位點(diǎn)BssHⅡ，因此將缺失的約90 bp的序列(實(shí)際上包括20 bp的錯(cuò)誤序列)連同其后的約100 bp的序列通過人工合成，這樣獲得一段總長(zhǎng)約190 bp的人工合成的基因片段。合成的基因片段通過BssHⅡ酶切位點(diǎn)與缺失的Efsec基因片段(命名為Efsec-)相連接而補(bǔ)齊，即可獲得完整的Efsec基因。見圖1。

圖1 Efsec基因拼接策略和設(shè)計(jì)

1.2.2 基因片段的合成、拼接與克隆 190 bp的基因片段委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，合成的基因片段克隆到pMD18-T載體。合成的190 bp片段用SphⅠ和BssHⅡ從pMD18-T中切下來，而Efsec-基因片段從pOTB7-EFsec質(zhì)粒中用BssHⅡ和BglⅡ切下來(大小為2 000 bp，含3'UTR)，然后將兩者做連接，再以連接產(chǎn)物為模板采用PCR方法擴(kuò)增出ORF序列。擴(kuò)增時(shí)使用的PCR引物已加酶切位點(diǎn)(BamHⅠ，EcoRⅠ)：上 游 引 物 LefsecR-2：5'ACTGGATCCATTATGGCAGGGCGGCGGGTG 3';下游引物 LefsecR-α：5'TGCGAATTCTGGGGGAGGTCACCGGACACTC 3'。經(jīng)過酶切后可連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)，從而獲得該基因的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EFsec。該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證是否符合預(yù)期，確保未發(fā)生突變。上述有關(guān)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、PCR等主要參照《分子克隆》中的方法進(jìn)行。

1.2.3 重組質(zhì)粒有效性初步鑒定 在完成基因拼接和pcDNA3.1-Efsec質(zhì)粒構(gòu)建后，為了初步檢驗(yàn)該質(zhì)粒的有效性，采用脂質(zhì)體(瞬時(shí))轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后第3日收集細(xì)胞，提取總RNA，并以RT-PCR方法檢測(cè)Efsec情況，PCR 引物為 Efg-s：5'CTTTGACAAGCAGCCGCAGAG 3'和 Efg-a：5'TGGGATGGAAATCTGGGACG 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為540 bp。

2 結(jié)果

2.1 190 bp基因小片段的合成及其與EFsec－基因片段的拼接、克隆 190 bp基因小片段合成后連入pMD18-T載體，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證無誤。然后按照上述實(shí)驗(yàn)方法將該基因片段以及EF-sec-基因片段分別切下來，連接，并使用LefsecR-s和LefsecR-a引物擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增時(shí)使用了Teq酶和Pfu酶分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只有Pfu酶擴(kuò)增獲得良好結(jié)果。擴(kuò)增的產(chǎn)物為完整EFsec基因的編碼框部分，大小約1 800 bp(圖2A)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、酶切，連接到pcDNA3.1(-)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后涂板，將長(zhǎng)出的細(xì)菌克隆隨即挑選數(shù)個(gè)用以鑒定重組質(zhì)粒，將其中4個(gè)提取質(zhì)粒做大小鑒定，均為陽性克隆(圖2B);再?gòu)倪@4個(gè)質(zhì)粒中取3、4號(hào)做酶切鑒定，再次確認(rèn)為重組克隆(圖2C)，最后經(jīng)測(cè)序證明這兩個(gè)克隆完全正確并無突變產(chǎn)生(圖3)。

圖2 pcDNA3.1-EFsec表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 通過轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞初步鑒定重組質(zhì)粒的有效性將pcDNA3.1-EFsec表達(dá)質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)利用 pcDNA3.1-GFP質(zhì)粒進(jìn)行對(duì)照，其綠色熒光可比較準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后第2天觀察細(xì)胞，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)是成功的(圖4)。然后收集細(xì)胞提取總RNA做RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EFsec質(zhì)粒的細(xì)胞中EFsec基因發(fā)生了大量的表達(dá)，而正常HEK293T細(xì)胞以及pcDNA3.1-GFP對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則未能檢測(cè)到EFsec基因發(fā)生了大量的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這就意味著該基因在培養(yǎng)條件下的細(xì)胞中是不表達(dá)的，但其重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后則發(fā)生強(qiáng)制性的表達(dá)，說明成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。

圖3 pcDNA3.1-Efsec重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定(局部)

圖4 pcDNA3.1-EFsec重組質(zhì)粒有效性鑒定

3 討論

EFsec在Sec通過特殊翻譯機(jī)制參入到硒蛋白的過程中起著重要作用，是Sec的編碼密碼子UGA正確解碼的一個(gè)關(guān)鍵的反式作用因子〔6，8〕。而本實(shí)驗(yàn)室所保存的pOTB7-EFsec質(zhì)粒中插入的EFsec-由于缺失一段堿基而并不是一個(gè)完整的功能正常的基因，因此在研究EFsec基因在硒蛋白生物合成中的作用機(jī)制前需要將它補(bǔ)齊。對(duì)于較短的基因片段，采取人工合成是優(yōu)先選擇，既快捷又經(jīng)濟(jì)。那么基因片段如何破解呢?很多實(shí)驗(yàn)的做法是采取退火方法，使相互有局部重疊的兩個(gè)片段在退火時(shí)完成拼接。這種辦法發(fā)生錯(cuò)配的概率不小，會(huì)造成一些突變，從而需要修正，甚至是反復(fù)的修正。本研究的策略是利用基因序列中突然存在的酶切位點(diǎn)來拼接基因片段，這種方式可以說不存在拼接中發(fā)生突變的可能，而且也是比較方便快捷的方法。在確定拼接酶切位點(diǎn)時(shí)需要注意的是應(yīng)該選擇離拼接一段盡可能近的位點(diǎn)，并且選擇常用的限制性內(nèi)切酶。酶連后采用PCR擴(kuò)增的方法也是本實(shí)驗(yàn)中證明極其有效迅速的方法，當(dāng)然必須要選擇高保真酶，確保PCR擴(kuò)增不出現(xiàn)突變。

將連接后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即完成拼接的EFsec基因片段連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)獲得正確的重組質(zhì)粒后，本研究將其轉(zhuǎn)染了哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T，用以驗(yàn)證基因及其重組質(zhì)粒的有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本來在正常培養(yǎng)條件下的HEK293T細(xì)胞中不表達(dá)的EFsec基因獲得了強(qiáng)制性表達(dá)，說明表達(dá)載體構(gòu)建是成功的。另外，在正常培養(yǎng)條件下HEK293T細(xì)胞中不表達(dá)EFsec基因，這正好說明EFsec的特殊性，即它完全是為硒蛋白的合成而存在的。實(shí)際上，硒蛋白的合成必須要在硒元素存在時(shí)才發(fā)生，而體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)缺乏硒元素〔9〕。這就說明，硒可能直接或間接地調(diào)節(jié)EFsec的表達(dá)?？傊?，本研究提供了一種有效的、準(zhǔn)確快捷的基因拼接策略和方法，克隆了功能完善的EFsec基因并進(jìn)行了初步表達(dá)分析，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 Kryukov GV，Castellano S，Novoselov SV，et al.Characterization of mammalian selenoproteomes〔J〕.Science，2003;300：1439-43.

2 Heras IL，Palomo M，Madrid Y.Selenoproteins：the key factor in selenium essentiality.State of the art analytical techniques for selenoprotein studies〔J〕.Anal Bioanal Chem，2011;400(6)：1717-27.

3 Méplan C，Hughes DJ，Pardini B，et al.Genetic variants in selenoprotein genes increase risk of colorectal cancer〔J〕.Carcinogenesis，2010;31：1074-9.

4 Allmang C，Krol A.Selenoprotein synthesis：UGA does not end the story〔J〕.Biochimie，2006;88(11)：1561-71.

5 Small-Howard A，Morozova N，Stoytcheva Z，et al.Supramolecular complexes mediate selenocysteine incorporation in vivo〔J〕.Mol Cell Biol，2006;26(6)：2337-46.

6 Berrya MJ，Tujebajevaa RM，Copelandb PR，et al.Selenocysteine incorporation directed from the 3'UTR：Characterization of eukaryotic EFsec and mechanistic implications〔J〕.Bio Factors，2001;14：17-24.

7 Donovan J，Caban K，Ranaweera R.A novel protein domain induces high affinity selenocysteine insertion sequence binding and elongation factor recruitment〔J〕.JBC，2008;283(50)：35129-39.

8 Fagegaltier D，Hubert N，Yamada K，et al.Characterization of mSelB，a novel mammalian elongation factor for selenoprotein translation〔J〕.EMBO J，2000;19(17)：4796-805.

9 Reszka E，Gromadzinska J，Stanczyk M，et al.Effect of selenium on expression of selenoproteins in mouse fibrosarcoma cells〔J〕.Biol Trace Elem Res，2005;104(2)：165-72.