老年宮頸鱗癌患者HPV16/18感染與組織蛋白酶-D和血管內(nèi)皮生長因子的關(guān)系

林芳惠 吳丹梅 (?？谑杏媱澤?wù)站婦產(chǎn)科，海南 海口 570208)

宮頸鱗癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)生與發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果。研究表明，人乳頭瘤狀病毒(HPV)是宮頸鱗癌的主要危險因素，且老年人發(fā)病率逐年增高〔1〕。組織蛋白酶-D是一種蛋白水解酶，其表達可能與腫瘤預(yù)后有關(guān)〔2〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是重要的血管生長促進因子，在腫瘤中表達升高〔3〕。組織蛋白酶-D和VEGF可能在腫瘤中具有一定協(xié)同作用〔4〕。本實驗探討老年宮頸鱗癌組織中HPV16/18感染與組織蛋白酶-D和VEGF表達的關(guān)系，以期為研究腫瘤生物學(xué)行為及其防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 我院宮頸鱗癌老年患者術(shù)后預(yù)留的新鮮組織85例，并立即置于－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。觀察組年齡60～78(平均67.1)歲。癌組織均符合WHO宮頸鱗癌診斷標(biāo)準。排除：①術(shù)前進行放、化療;②臨床資料不完整;③合并其他內(nèi)臟器官嚴重疾病。老年人子宮切除術(shù)(非腫瘤病變)后慢性宮頸炎組織新鮮標(biāo)本60例為對照組，年齡60～77(平均67.4)歲。兩組一般臨床特征無明顯差別，具有可比性。

1.2 方法 HPV16/18原位雜交檢測試劑盒和生物素標(biāo)記的HPV16/18探針購自福建泰普生物科學(xué)有限公司。原位雜交具體步驟：切片脫蠟水化;加蛋白酶K，37℃孵育18 min，梯度酒精脫水，每張切片加入10 μl生物素化探針，加蓋玻片，95℃變性10 min，取出后迅速冷卻，37℃下溫箱中雜交3 h，去掉蓋玻片;加SP-AP結(jié)合物，37℃孵育30 min，加BCIP/NBT室溫顯色5～15 min，核固紅復(fù)染，中性樹膠封片。組織蛋白酶-D和VEGF檢測試劑盒均購自北京中杉金橋公司，流式細胞術(shù)檢測參考劉愛東等〔2，5〕方法制備單細胞懸液(1 × 106ml－1)后，抽取1 ml，分別加入組織蛋白酶-D和VEGF稀釋液，在室溫中孵育30 min，加入PBS 10 ml洗滌后，棄去上清液，加入FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min后，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清除去未結(jié)合的熒光二抗。加入PBS 0.1 ml，經(jīng)銅網(wǎng)過濾后上機檢測。采用美國FACS420流式細胞儀進行檢測。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準 應(yīng)用熒光指數(shù)(FI)表示結(jié)果，

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SAS統(tǒng)計軟件進行t和χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對照組HPV16/18陽性率比較 觀察組HPV16/18表達陽性率〔60(70.59%)〕明顯高于對照組〔6(10.00%)〕(χ2=52.064 7，P ＜0.000 1)。

2.2 兩組組織蛋白酶-D和VEGF蛋白表達量比較 觀察組組織蛋白酶-D(1.48±0.36)和 VEGF蛋白表達量(1.43±0.31)明顯高于對照組(1.00±0.13)、(1.00±0.26)(t=11.63，P=0.001 2;t=10.31，P=0.004 6)。

2.3 宮頸鱗癌組織中HPV16/18、組織蛋白酶-D和VEGF表達的關(guān)系 HPV16/18陽性組中組織蛋白酶-D(1.59±0.16)和VEGF蛋白的表達量(1.52±0.24)明顯高于HPV16/18陰性組(1.12 ±0.12、1.19 ± 0.21)(t=10.34，P=0.007 5;t=8.91，P=0.010 2)。

3 討論

HPV是一種DNA病毒，屬于乳頭多泡病毒家族，約8 000堿基對構(gòu)成，在DNA的結(jié)構(gòu)上包括L1-E7和LCR一共9個基因組，其編碼相對應(yīng)的基因產(chǎn)物。依據(jù)其致癌作用的程度分為低危型、高危型和可能致癌型，其中高危型HPV16/18不僅在年輕人宮頸癌中增多，而且在老年宮頸鱗癌組織和細胞中檢出率也明顯增高〔6，7〕。宮頸鱗癌生長和擴散是重要的生物學(xué)行為，血管生成在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，也是影響宮頸鱗癌患者術(shù)后生存的關(guān)鍵因素。VEGF是目前研究最多的促血管生成因子，對腫瘤基質(zhì)血管形成及腫瘤生物學(xué)行均有重要影響，尤其對腫瘤發(fā)展時的血管新生有明顯促進作用〔8，9〕。組織蛋白酶-D是一種相對分子量為34 kD的門冬氨酸內(nèi)蛋白酶，能溶解基底膜、細胞外基質(zhì)(ECM)和結(jié)締組織，促進腫瘤脈管生成，并刺激癌細胞生長。也有觀點認為組織蛋白酶-D存在于所有細胞中，一方面可通過水解作用降解ECM，參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，另一方面，可以激活組織蛋白酶B，再次激活尿激酶激活因子，并與其受體結(jié)合，調(diào)節(jié)與腫瘤有關(guān)的蛋白分解作用〔10〕。

本實驗結(jié)果提示HPV16/18、組織蛋白酶-D和VEGF在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，HPV16/18與組織蛋白酶-D和VEGF可能具有協(xié)同作用，組織蛋白酶-D可能作為上游蛋白，促進VEGF高表達，進而促進腫瘤血管生成，對宮頸鱗癌進展有重要的促進作用。HPV16/18可能對組織蛋白酶-D表達水平的調(diào)節(jié)有直接或間接影響，同時組織蛋白酶-D也可通過對凋亡細胞的調(diào)節(jié)參與HPV介導(dǎo)的對鱗狀上皮細胞正常分化的調(diào)節(jié)障礙，其機制可能與HPV16/18編碼的基因表達產(chǎn)物，特別是HPVE6、E7或E2蛋白有直接或間接影響。也有觀點認為腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移時，瘤細胞自脫離原瘤灶到轉(zhuǎn)移灶的過程中，至少應(yīng)穿越兩次血管壁并向周圍組織侵襲，而此過程中，組織蛋白酶-D能對基質(zhì)金屬蛋白酶進行有效調(diào)節(jié)，并對ECM有明顯降解作用〔11〕，而且作用過程中，也對腫瘤血管生成起明顯調(diào)節(jié)作用。HPV16/18對組織蛋白酶-D和VEGF的調(diào)節(jié)作用尚不完全清楚，需深入研究闡明。綜上，高危型HPV16/18感染是老年宮頸鱗癌發(fā)生的主要原因，HPV16/18感染導(dǎo)致組織蛋白酶-D和VEGF蛋白表達增高，在老年人宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展起重要作用。

1 嚴麗華，吳向坤，杜 峰，等.老年宮頸癌50例臨床及預(yù)后分析〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2011;11(15)：2928-30.

2 Wozniak B，Mila-Kierzenkowska C，Wozniak A，et al.The effect of combined therapy on activity of cathepsin D and alpha-1-antitrypsin in the blood serum of women with cervical cancer〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2008;29(6)：617-9.

3 劉愛東.流式細胞術(shù)檢測胃癌中血管內(nèi)皮生長因子的表達及意義〔J〕. 中國中醫(yī)藥資訊，2011;3(5)：219.

4 韓瑞珠，李 鵬，李曉丹.E-鈣黏蛋白和組織蛋白酶-D與血管內(nèi)皮生長因子在喉鱗癌轉(zhuǎn)移中的作用〔J〕.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2005;12(2)：77-80.

5 劉愛東，劉士生，許志萍，等.E-cadherin在胃癌中的表達及意義〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2007;28(11)：1806-7.

6 Huang Q，Qu QX，Xie F，et al.CD40 is overexpressed by HPV16/18-E6 positive cervical carcinoma and correlated with clinical parameters and vascular density〔J〕.Cancer Epidemiol，2011;35(4)：388-92.

7 鄭曙民，陳 星，周秀英，等.宮頸鱗癌與HPV16和18及VEGF和TGF-β1 關(guān)系的探討〔J〕. 腫瘤防治雜志，2004;11(6)：573-5.

8 Kuemmel S，Thomas A，Landt S，et al.Circulating vascular endothelial growth factors and their soluble receptors in pre-invasive，invasive and recurrent cervical cancer〔J〕.Anticancer Res，2009;29(2)：641-5.

9 劉愛東，龐久玲，劉士生.胃癌中基質(zhì)金屬蛋白酶-9和CD105表達關(guān)系的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009;29(7)：886-7.

10 Masson O，Prébois C，Derocq D，et al.Cathepsin-D，a key protease in breast cancer，is up-regulated in obese mouse and human adipose tissue，and controls adipogenesis〔J〕.PLoS One，2011;6(2)：e16452.

11 烏拉木，余科達，沈鎮(zhèn)宙，等.組織蛋白酶D在乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌及伴早期浸潤中的表達及其與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.中國癌癥雜志，2010;20(4)：247-50.