生物鐘基因Npas2在老年乳腺癌患者中的表達(dá)及其臨床意義

李新白 袁 彤 金美善 佟 倜 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 300)

流行病學(xué)研究顯示，機(jī)體晝夜節(jié)律周期的破壞如長期熬夜、倒班工作、跨時(shí)區(qū)飛行等與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)〔1，2〕。生物的晝夜節(jié)律失調(diào)是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的內(nèi)在因素之一〔3〕，生物鐘基因?qū)θ梭w的病理生物周期行為的調(diào)控具有重要作用。Npas2基因是已檢測(cè)到的最大生物鐘基因，在中樞和外周組織中均有表達(dá)。證據(jù)表明，生物鐘基因Npas2在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和腫瘤生長抑制等過程中參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔4，5〕。但Npas2基因在乳腺癌中如何表達(dá)以及與乳腺癌病理分型、轉(zhuǎn)移、侵襲的關(guān)系國內(nèi)報(bào)道不多。本研究旨在探討Npas2與乳腺癌生長和侵襲的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選擇吉林大學(xué)第一醫(yī)院2009年4月至2009年12月行乳腺手術(shù)的患者50例。臨床資料齊全，年齡60～72〔平均 (66.8±6.5)〕歲。所有病例術(shù)前均未行放射和化學(xué)治療，且經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，其中乳腺原位癌20例，乳腺浸潤癌30例，行乳腺癌改良根治術(shù);距離病變3 cm以上取瘤旁組織作為正常乳腺組織，共50例，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟 (UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Tis 20例，Ⅰ期9例、Ⅱ期16例、Ⅲ期5例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。

1.1.2 試劑 Npas2抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;生物素-親和素-過氧化物復(fù)合物 (SP)-9710試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 Npas2蛋白免疫組化 取臨床標(biāo)本組織制成4 μm切片2張，1張切片用于蘇木素-伊紅 (HE)染色，1張用于免疫組化。Npas2抗體檢測(cè)采用免疫組化SP法，DAB顯色。切好的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。滴加3%過氧化氫溶液室溫處理10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗 (5 min×3次)。正常山羊免疫血清封閉，室溫孵育15 min，傾去血清，滴加按1∶100稀釋的Npas2抗體，4℃冰箱過夜。PBS沖洗 (5 min×3次)。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫10 min。PBS沖洗 (5 min×3次)。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫10 min。PBS沖洗 (5 min×3次)。DAB顯色。常規(guī)HE復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定 Npas2抗體染色陽性物表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核為棕黃色顆粒;細(xì)胞核用HE復(fù)染，陽性的染為紫黑色，陰性為胞核藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)無色。每張切片采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析儀，在200倍鏡下連續(xù)觀察5個(gè)視野檢測(cè)，測(cè)量灰度值，以灰度值表示Npas2蛋白表達(dá)情況，灰度值越小陽性表達(dá)越高。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，抗體灰度值采用s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 在乳腺正常組織、乳腺原位癌和浸癌癌中Npas2蛋白的表達(dá) Npas2蛋白在正常乳腺組織、乳腺原位癌和浸潤癌中均有表達(dá)，在正常乳腺組織中，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量棕黃色顆粒染色，NPAS2陽性表達(dá)灰度值為114.3±2.31;在原位癌中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抗體灰度值為132.3±2.11;在浸潤癌中細(xì)胞質(zhì)表達(dá)明顯降低，呈淡黃色或著色淺，其灰度值為159.5±6.79。與正常組織比較，浸潤癌和原位癌中Npas2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見圖1～圖3。

2.2 Npas2蛋白的表達(dá)與乳腺腫瘤病理特征的關(guān)系 乳腺原位癌和乳腺浸潤癌免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Npas2表達(dá)與腫瘤分期有相關(guān)性。與原位癌 (132.3±2.11)和Ⅰ期乳腺癌(142.3±2.46)比較，在Ⅱ期 (161.2±4.22)和Ⅲ期(176.3±2.93)乳腺癌中Npas2表達(dá)明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。乳腺浸潤癌中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (166.3±4.04)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (156.8±3.23)比較，Npas2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，考慮可能與納入的樣本數(shù)不夠有關(guān)。

圖1 Npas2在正常乳腺組織中的陽性表達(dá)(×200)

圖2 乳腺原位癌中Npas2蛋白的表達(dá)(×200)

圖3 乳腺浸潤癌中Npas2蛋白的表達(dá)(×200)

3 討論

生物體的許多活動(dòng)和生理行為均以24 h為周期呈節(jié)律性振蕩。生物節(jié)律在分子水平表現(xiàn)為生物鐘基因及其相關(guān)蛋白產(chǎn)物可以作為腫瘤抑制因子，參與調(diào)控細(xì)胞分裂、增殖、凋亡和細(xì)胞周期〔5〕。目前普遍認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡所致，受多種基因和蛋白等因素控制;同時(shí)，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素作用、多基因參與、經(jīng)過多階段才最終形成的極其復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。對(duì)人體腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，生物的晝夜節(jié)律失調(diào)是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的內(nèi)在因素之一。晝夜節(jié)律的破壞與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)〔1，2〕，是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)之一。

許多學(xué)者認(rèn)為Npas2可能作為潛在腫瘤抑制因子〔6，7〕，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和腫瘤生長抑制的過程等多方面參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。現(xiàn)有證據(jù)表明，Npas2的基因多態(tài)性和基因錯(cuò)義突變與人類腫瘤包括乳腺癌和淋巴瘤的發(fā)病危險(xiǎn)存在一定的聯(lián)系〔6，8〕。Npas2基因編碼一種具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋/過碘酸-雪夫結(jié)構(gòu)域 (basic helix-loop-helix-PAS，bHLHPAS)轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)，在前腦和外周組織均有表達(dá)。bHLH-PAS蛋白是控制多種生理發(fā)生和發(fā)育過程基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，在控制各種細(xì)胞事件中起著關(guān)鍵作用〔4〕。Npas2蛋白與BMAL1蛋白形成異二聚體，與靶基因啟動(dòng)部位的e盒結(jié)合，啟動(dòng)Per1、Per2、Per3和Cry1、Cry2基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)生物節(jié)律〔9，10〕。PER和CRY蛋白是反饋環(huán)中的負(fù)性因素?？紤]Npas2可能作為潛在的腫瘤抑制因子，其蛋白在腫瘤中表達(dá)可能是下調(diào)的。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Npas2蛋白在正常乳腺組織呈陽性表達(dá)，在乳腺原位癌和浸潤癌中表達(dá)較正常乳腺組織明顯減弱，推測(cè)Npas2蛋白存在于正常乳腺組織中維持乳腺正常形態(tài)和功能，NPAS2表達(dá)減弱可能使乳腺組織的形態(tài)和功能發(fā)生改變，可能導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。提示Npas2表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Npas2表達(dá)與腫瘤分期有相關(guān)性，在乳腺原位癌和I期浸潤癌中表達(dá)相對(duì)較高，提示Npas2高表達(dá)可能在乳腺癌發(fā)展中具有保護(hù)性作用。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)生物鐘基因Per1和Per2高表達(dá)能抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的生長。Per1和Per2是Npas2作用的靶基因，Npas2高表達(dá)可能刺激Per1和Per2高表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。這可能從分子水平解釋乳腺癌Npas2高表達(dá)和良好生存預(yù)后的關(guān)系。

1 Lie JA，Roessink J，Kjaerheim K.Breast cancer and night work among Norwegian nurses〔J〕.Cancer Causes Control，2006;17(1)：39-44.

2 Stevens RG.Circadian disruption and breast cancer：from melatonin to clock genes〔J〕.Epidemiology，2005;16(2)：254-8.

3 Moser M，Schaumberger K，Schernhammer E，et al.Cancer and rhythm〔J〕.Cancer Causes Control，2006;17(4)：483-7.

4 Wood PA，Yang X，Hrushesky WJ.Clock genes and cancer〔J〕.Integr Cancer Ther，2009;8(4)：303-8.

5 王雅平，華魯純，張延齡.生物鐘基因與腫瘤〔J〕.國際外科學(xué)雜志，2006;33(4)：279-83.

6 Zhu Y，Stevens RG，Leaderer D，et al.Non-synonymous polymorphisms in the circadian gene Npas2 and breast cancer risk〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2008;107(3)：421-5.

7 Hoffman AE，Zheng T，Ba Y，et al.The circadian gene Npas2，a putative tumor suppressor，is involved in DNA damage response〔J〕.Mol Cancer Res，2008;6(9)：1461-8.

8 Yi C，Mu C，de la Longrais IA，et al.The circadian gene Npas2 is a novel prognostic biomarker for breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2010;120(3)：663-9.

9 DeBruyne JP，Weaver DR，Reppert SM.CLOCK and Npas2 have overlapping roles in the suprachiasmatic circadian clock〔J〕.Nat Neurosci，2007;10(5)：543-5.

10 Hua H，Wang Y，Wan C，et al.Circadian gene mPer2 overexpression induces cancer cell apoptosis〔J〕.Cancer Sci，2006;97(7)：589-96.