新疆和田地區(qū)維吾爾族帕金森病LRRK2基因S1647T多態(tài)性分析

閆薈如 馬青平 楊新玲 李紅娟 (新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)醫(yī)學中心，新疆 烏魯木齊 830054)

帕金森病(PD)是一種常見于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，各研究表明遺傳因素在PD的病因中起著重要作用，其中LRRK2是重要的易感基因之一。目前已證實LRRK2基因約有20多個突變位點與PD相關(guān)，突變類型具有明顯的區(qū)域和種族差異性。目前尚未見國外學者對S1647T多態(tài)的研究報道，我國大陸的Zheng等〔1〕和臺灣的 Lin等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)與中國漢族人群PD的發(fā)生有關(guān)。本研究選擇新疆和田地區(qū)維族帕金森患者及健康對照者為研究對象，觀察LRRK2基因多態(tài)位點S1647T與新疆和田地區(qū)維族帕金森病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 診斷標準 病例組為在流調(diào)基礎(chǔ)上得到的PD患者(均為散發(fā)性)，對照組為從調(diào)查地點選擇的生活背景與PD患者相似，年齡、性別、族別等相互匹配，并且經(jīng)嚴格檢查確定無血緣關(guān)系的健康非PD者。以英國BrainBank診斷標準進行篩查，部分診斷困難者再由神經(jīng)內(nèi)科資深專家進行審核確診，必要時行頭顱核磁或CT證實。發(fā)病年齡以50歲為界分為早發(fā)PD組和遲發(fā)PD組。排除繼發(fā)性PD和帕金森疊加綜合征以及神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病、甲狀腺功能亢進、遺傳病等。

1.2 一般資料 病例組124例，男72例，女52例，發(fā)病年齡31～95(62.7±12.6)歲;對照組130名，男76例，女54例，年齡33～90(60.9±11.6)歲。病例組與對照組的性別構(gòu)成、年齡間差異均無統(tǒng)計學意義(χ2性別 =0.004，P＞0.05;t年齡 =1.138，P ＞0.05)。

1.3 方法

1.3.1 DNA制備 所有患者及正常對照者都經(jīng)知情同意。取外周肘靜脈血2 ml按常規(guī)酚/氯仿法抽提基因組DNA，檢測DNA 純度在1.7～1.9，濃度≥10 ng/μl，－20℃保存。

1.3.2 引物的設(shè)計 根據(jù)National Center for Biotechnology Information(NCBI)及ensembl中的DNA序列庫中LRRK2基因S1647T所在的Exon34的DNA序列，設(shè)計S1647T引物序列，上游：5'-CTTCTAGGCCACATGGTTG-3';下 游：5'-TCCTATTGGCAAAGCAATCT-3'，擴增片斷長度為326 bp，引物由北京華大生物公司合成。

1.3.3 擴增LRRK2基因第34號外顯子 PCR總體積為25 μl。100 ng/μl上下游引物各為 0.5 μl，MIX10 μl，50 ng/μl gDNA 3.0 μl，ddH2O 11 μl。PCR 反應條件為：S1647T 反應條件：94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，57.8℃退火 30 s，72℃延伸20 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3.4 PCR擴增產(chǎn)物檢測與基因型鑒定 取7 μl PCR產(chǎn)物，加入上樣緩沖液(2×溴芬蘭)混勻后，上樣于2%瓊脂糖凝膠，核酸染料染色，D50 Marker做標準對照，4 V/cm電壓電泳，紫外儀上觀察，拍照。擴增片段長度為326 bp。

1.3.5 DNA測序法基因型分析 TT型為純合子(野生型);TA型為雜合子突變;AA型為純合子突變。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用 SPSS17.0軟件進行分析?；蛐皖l率及等位基因頻率采用基因計數(shù)法，計數(shù)資料以率(%)表示，兩組間等位基因頻率和基因型頻率分布的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗 病例組與對照組兩個多態(tài)性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，吻合度良好(PD 組 χ2=0.080，P ＞0.05，對照組 χ2=0.410，P ＞0.05)。

2.2 LRRK2基因S1647T位點多態(tài)性測序結(jié)果 見圖1。

圖1 LRRK2基因S1647T多態(tài)位點測序圖

2.3 PD組與對照組S1647T多態(tài)基因型頻率和等位基因頻率比較 PD組和對照組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.98，P=0.613 和 χ2=0.218，P=0.64)。見表1。

表1 PD組與對照組S1647T多態(tài)基因型頻率和等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.4 不同年齡PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較 早發(fā)PD組與≤50歲對照組(χ2=0.953，P=0.621和χ2=0.584，P=0.445)，遲發(fā) PD組與 ＞50歲對照組(χ2=0.384，P=0.825 和 χ2=0.019，P=0.891)之間基因型頻率和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 不同年齡PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較〔n(%)〕

2.5 不同性別PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較 男性PD組與男性對照組(χ2=0.416，P=0.812和χ2=0.213，P=0.644)，女性PD組與女性對照組(χ2=0.726，P=0.696 和 χ2=0.033，P=0.857)基因型頻率和等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 不同性別PD患者與對照者S1647T基因型頻率和等位基因頻率分布的比較〔n(%)〕

3 討論

近年來，隨著諸多PD相關(guān)易感基因的發(fā)現(xiàn)，人們意識到遺傳因素對PD發(fā)病所起的重要作用。LRRK2基因又名PARK8，位于染色體12q2，全長7 584個堿基，有51個外顯子，是常染色體顯性遺傳PD中突變頻率最高的致病基因，也是最常見的遲發(fā)型PD的致病基因。

LRRK2基因突變具有明顯的地域和種族差異：G2019S和R1441C在歐洲和北非高加索人群中常見〔3～5〕，在亞洲的突變卻非常少見，僅占LRRK2突變的0.1%左右。G2385R被報道是第一個中國人群特異的PD風險因子，由臺灣的Mata等〔6〕首次發(fā)現(xiàn)，隨后其突變研究成為熱點。G2385R在馬來人PD患者中突變頻率為2.0%，但同PD發(fā)病無相關(guān)性，在印度及高加索等其他種族中均未檢出這個多態(tài)〔7～9〕，然而在東亞各國家和地區(qū)的散發(fā)性PD患者常見該位點突變，突變頻率分別為中國大陸10%，新加坡7.27%，日本11.6%，臺灣8%〔10〕。R1628P是新近發(fā)現(xiàn)的一個突變位點，與G2385R類似，其攜帶者以雜合狀態(tài)為主，是散發(fā)性 PD 的一個風險因素〔11〕。Ross等〔12〕報道R1628P可能是第二個中國人群特異的 PD風險因子，與G2385R不同的是，在亞洲其他種族中未發(fā)現(xiàn)該位點突變，是漢族人群特異性的突變位點。

S1647T是除G2385R和R1628P之外又一與中國漢族PD發(fā)生有關(guān)的多態(tài)位點。Zheng等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)該位點的A等位基因增加了中國華南地區(qū)漢族人群PD的患病風險;臺灣的Lin等〔2〕研究證實S1647T多態(tài)協(xié)同環(huán)境因素致使人群的PD患病增加;同時Chang等〔13〕研究結(jié)果也表明S1647T位點的突變增加了中國漢族人群PD的發(fā)病風險。目前尚未見國外學者對該位點的研究報道。

本研究結(jié)果顯示，LRRK2基因S1647T多態(tài)以TT和TA基因型多見，AA基因型較少見。A等位基因頻率在PD組與對照組之間無明顯差異，提示A等位基因可能與新疆和田地區(qū)維族人群散發(fā)性PD遺傳風險可能無關(guān)，這與國內(nèi)Zheng等和Chang等文獻報道的結(jié)論不同，由于LRRK2基因突變類型存在明顯的種族及地域差異，新疆地區(qū)地處中亞，維吾爾族具有與漢族不同的遺傳背景，所選維吾爾族研究對象均為當?shù)鼐用?，同?nèi)地其他地區(qū)、民族未有通婚，研究對象同質(zhì)性較高，該研究結(jié)果進一步證實了LRRK2基因突變的地域和種族差異性，說明S1647T是中國漢族人群的突變熱點。按年齡分組，該研究表明S1647T位點基因型頻率及等位基因頻率在早發(fā)PD組和≤50歲對照組、遲發(fā)PD組和＞50歲對照組、早發(fā)PD組和遲發(fā)PD組間均無統(tǒng)計學意義。這與Chang等〔13〕研究證明的與早發(fā)型PD有關(guān)結(jié)論不同，這與樣本量不足、抽樣誤差以及Chang的研究對象主要來自四川有關(guān)，不同地區(qū)、種族、環(huán)境及生活習俗的差異也會造成的不同的結(jié)果。今后有必要繼續(xù)擴大樣本量在其他人群和民族中對該位點進行更進一步的研究。

1 Zheng Y，Liu Y，Wu Q，et al.Confirmation of LRRK2 S1647T variant as a risk factor for Parkinson's disease in Southern China〔J〕.Eur J Neurol，2011;18(3)：538-40.

2 Lin CH，Wu RM，Tai CH，et al.Lrrk2 S1647T and BDNF V66M interact with environmental factors to increase risk of Parkinson's disease〔J〕.Parkinsonism Relat Disord，2011;17(2)：84-8.

3 Lesage S，Dürr A，Tazir M，et al.LRRK2 G2019S as a cause of Parkinson's disease in North African Arabs〔J〕.N Engl J Med，2006;354(4)：422-3.

4 Ozelius LJ，Senthil G，Saunders-Pullman R，et al.LRRK2 G2019S as a cause of Parkinson's disease in Ashkenazi Jews〔M〕.N Engl J Med，2006;354(4)：424-5.

5 Simón-Sánchez J，Martí-Massó JF，Sánchez-Mut JV，et al.Parkinson's disease due to the R1441G mutation in Dardarin：a founder effect in the Basques〔J〕.Mov Disord，2006;21(11)：1954-9.

6 Mata IF，Kachergus JM，Taylor JP，et al.LRRK2 pathogenic substitutions in Parkinson's disease〔J〕.Neurogenetics，2005;6(1)：171-7.

7 Tan EK，Zhao Y，Tan L，et al.Analysis of LRRK2 Gly2385Arg genetic variant in non-Chinese Asians〔J〕.Mov Disord，2007;22(12)：1816-8.

8 Haubenberger D，Bonelli S，Hotzy C，et al.A novel LRRK2 mutation in an Austrian cohort of patients with Parkinson's disease〔J〕.Mov Disord，2007;22(11)：1640-3.

9 Toft M，Haugarvoll K，Ross OA，et al.LRRK2 and Parkinson's disease in Norway〔J〕.Acta Neurol Scand Suppl，2007;187：72-5.

10 Li C，Ting Z，Qin X，et al.The Prevalence of LRRK2 Gly2385Arg variant in Chinese Han population with Parkinson's disease〔J〕.Mov Disord(S0885-3185)，2007;22(16)：2439-43.

11 Lu CS，Wu-Chou YH，Van Doeselaar M，et al.The LRRK2 Arg1628Pro variant is a risk factor for Pakinson's disease in the Chinese population〔J〕.Neurogenetics，2008;9(4)：1364-75.

12 Ross OA，Wu YR，Lee MC，et al.Analysis of Lrrk2 R1628P as a risk factor for Parkinson's disease〔J〕.Ann Neurol，2008;64(1)：88-92.

13 Chang XL，Mao XY，Zhang ZJ，et al.Correlation between LRRK2 gene polymorphism sites S1647T and R1398H and Parkinson's disease in a Chinese Han population〔J〕.Neural Regen Res，2011;6(5)：340-5.