熒光定量PCR技術(shù)對(duì)前驅(qū)期小兒結(jié)核性腦膜炎的應(yīng)用價(jià)值

劉彥軒 賈安奎 郭盛菊 石太新 尚好珍

結(jié)核性腦膜炎（簡(jiǎn)稱“結(jié)腦”）是由Mt b侵入蛛網(wǎng)膜下腔引起軟腦膜、蛛網(wǎng)膜病變，進(jìn)而累及腦實(shí)質(zhì)和腦血管的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病，是小兒最常見和最嚴(yán)重的肺外結(jié)核病之一，死亡率高達(dá)30%～50%，存活患兒中約20%～50%遺留永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥（偏癱、失語、失明等），若早期診斷和及時(shí)合理治療，大多數(shù)患者可獲痊愈，因此早期診斷是決定患兒預(yù)后的關(guān)鍵因素［1］。但目前臨床診斷結(jié)腦，多依靠病史、癥狀、體征、試驗(yàn)性治療及實(shí)驗(yàn)室檢查等綜合性指標(biāo)來判定，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法如涂片、培養(yǎng)和結(jié)核抗體檢測(cè)等方法難以滿足臨床早期診斷的需要。陳效友等［2］報(bào)道以Taq酶標(biāo)記的FQ-PCR檢測(cè)痰和血標(biāo)本中Mt b靈敏度高達(dá)10-18kg DNA和1～5個(gè)菌體／ml，比普通PCR高10～100倍。為進(jìn)一步研究其對(duì)結(jié)腦早期診斷、療效評(píng)估及與預(yù)后的關(guān)系、作用和意義，筆者做了以下探討，以期為臨床提供診療思路和積累試驗(yàn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

2007年3月至2011年2月間河南省結(jié)核病醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科和河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院豫北兒科診療中心5個(gè)小兒內(nèi)科的住院患兒共147例。納入研究的小兒分為結(jié)腦組和對(duì)照組。

1．結(jié)腦組：為前驅(qū)期結(jié)腦患兒，共117例。其中男61例，女56例；年齡6個(gè)月至7歲，中位年齡2．2歲，平均2．4歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患有肺結(jié)核或有與活動(dòng)性結(jié)核病患者密切接觸史的患兒，煩躁、精神萎靡、呆滯、嗜睡、消瘦或體質(zhì)量不增、低熱，不明原因反復(fù)嘔吐，嬰幼兒皺眉、以手擊頭、啼哭，年長(zhǎng)患兒自訴頭疼，無抗結(jié)核治療史且腦脊液Mt b培養(yǎng)陽性（符合“金標(biāo)準(zhǔn)”）。排除標(biāo)準(zhǔn)：腦脊液 Mt b培養(yǎng)陰性，即選例時(shí)疑似結(jié)腦患者，治療前采集腦脊液檢測(cè)，隨即進(jìn)行治療，若培養(yǎng)Mt b陰性則不計(jì)入本組研究范圍。

2．對(duì)照組（非結(jié)腦組）：30例，男女各15例；年齡5個(gè)月至6．5歲，中位年齡2．4歲，平均2．7歲。為我院小兒內(nèi)科診斷為非結(jié)核分枝桿菌感染的腦膜炎或其他腦炎的住院患兒，納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征，腦脊液蛋白質(zhì)、氯化物、葡萄糖等生化指標(biāo)的變化，以及細(xì)胞種類和計(jì)數(shù)，一般抗生素治療有效或腦脊液中查到特異性病毒抗體Ig M，或培養(yǎng)出一般細(xì)菌［3］，且腦脊液培養(yǎng) Mtb陰性。病種包括：病毒性腦膜炎18例、化膿性腦膜炎6例、隱球菌腦膜炎5例、流行性乙型腦炎1例，此幾種疾病診斷符合參考文獻(xiàn)［4］的診斷。治療前采集腦脊液，再治療，若Mtb培養(yǎng)陽性或并發(fā)結(jié)腦者，則不計(jì)入該組研究范圍。

3．兩組一般臨床資料比較：各組間年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值均＞0．05），具有可比性（表1）。

表1 各組一般臨床資料比較

二、研究方法

治療前無菌采集所有疑似結(jié)腦患兒和對(duì)照組患兒腦脊液分別置于2個(gè)無菌試管，每管2 ml。均置4℃冰箱過夜，由另一實(shí)驗(yàn)員通過數(shù)字表法隨機(jī)編號(hào)，一管取薄膜層接種培養(yǎng)，另一管進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)，記錄培養(yǎng)和Mtb DNA結(jié)果，按上述納入標(biāo)準(zhǔn)選擇結(jié)腦組117例和對(duì)照組30例患兒，比較各統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

結(jié)腦組患兒抗結(jié)核治療3周后，再行培養(yǎng)和FQ-PCR檢測(cè)，分別計(jì)算陽性檢出率。

對(duì)結(jié)腦組患兒出院時(shí)培養(yǎng)和FQ-PCR陰性者，隨訪觀察2年并記錄復(fù)發(fā)情況；隨訪78例患者，另外32例未達(dá)隨訪時(shí)間繼續(xù)觀察，7例失訪。其治愈的標(biāo)準(zhǔn)是：（1）臨床癥狀、體征完全消失，無后遺癥。（2）腦脊液常規(guī)檢查正常（腦脊液外觀、細(xì)胞數(shù)、蛋白質(zhì)、糖、氯化物等）。（3）療程結(jié)束后隨訪觀察2年無復(fù)發(fā)。

結(jié)核性腦膜炎臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是腦脊液Mtb涂片或培養(yǎng)陽性。快速M(fèi)tb培養(yǎng)采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的BACTEC T M MGITTM960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)和配套培養(yǎng)基及相關(guān)試劑，培養(yǎng)和鑒定周期平均12 d。

FQ-PCR儀器為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)DA7600型擴(kuò)增儀，相關(guān)試劑由該公司提供。標(biāo)本處理如下：取腦脊液薄膜層100μl加入等量DNA濃縮液（主要成分為聚乙二醇600、Na Cl），振蕩數(shù)秒，9900×g離心10 min，棄上清液后加入50μl DNA提取液［主要成分為Na OH、Tris-HCl、Triton X-100、NP-40、Chelex-100、乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）］，于干式恒溫器（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：K30B）100℃恒溫浴10 min。以9900×g離心10 min，取上清液2μl加入毛細(xì)管進(jìn)行PCR反應(yīng)，每批加有陰、陽性質(zhì)控品和4個(gè)濃度的TB陽性定量參考品（結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供），擴(kuò)增檢測(cè)步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行，擴(kuò)增曲線呈s型，且Ct值＜30，Mt b-DNA含量＞5．0×101拷貝／ml為陽性。

FQ-PCR檢測(cè)靈敏度、特異度、診斷指數(shù)、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值指標(biāo)見參考文獻(xiàn)［5］。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、二組FQ-PCR檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)比較

金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)結(jié)果：結(jié)腦組（培養(yǎng)陽性117例），對(duì)照組（培養(yǎng)陰性30例）。

收集整理初診患兒符合條件的117例結(jié)腦組和30例對(duì)照組FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腦組FQPCR均為陽性，對(duì)照組FQ-PCR陰性29例，陽性1例（表2）。

表2 兩組FQ-PCR檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果比較（例）

FQ-PCR檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)比較靈敏度100．0%（117／117），特 異 度 96．7% （29／30），診 斷 指 數(shù)196．7%（100．0%＋96．7%）＞170．0%，陽性預(yù)測(cè)值99．2%（117／118），陰性預(yù)測(cè)值100．0%（29／29），符合率99．3%（146／147）。FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)采用四格表評(píng)價(jià)模式進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．000，P＝1．000）；相關(guān)性分析r＝0．9790，二者有相關(guān)關(guān)系（χ2＝140．9，P＝0．000）。

二、結(jié)腦組患兒抗結(jié)核治療3周后復(fù)檢結(jié)果

117例結(jié)腦組患兒抗結(jié)核治療3周后復(fù)檢，培養(yǎng)法、FQ-PCR法檢測(cè)陽性例數(shù)分別為32例和68例，陽性檢出率分別為27．35%（32／117）和58．12%（68／117）。兩者陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝22．63，P＝0．000）。患兒臨床癥狀均有不同程度好轉(zhuǎn)，其中有42例患者臨床癥狀基本消失，與FQPCR檢測(cè)陰性例數(shù)較為接近，此42例患兒的培養(yǎng)法和FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，培養(yǎng)法檢測(cè)陽性的32例患兒包含在FQ-PCR法檢測(cè)陽性的68例中。

三、隨訪患兒復(fù)發(fā)情況

筆者對(duì)結(jié)腦組患兒出院時(shí)培養(yǎng)法和FQ-PCR檢測(cè)陰性的患兒進(jìn)行了隨訪，觀察2年后復(fù)發(fā)情況。共隨訪78例患兒，另外32例未達(dá)隨訪時(shí)間，7例失訪。此78例患兒出院時(shí)培養(yǎng)法均為陰性，F(xiàn)Q-PCR法69例陰性，9例陽性。隨訪結(jié)果為培養(yǎng)法陰性的78例患兒有7例復(fù)發(fā)（8．97%），F(xiàn)Q-PCR陰性69例患兒0例復(fù)發(fā)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4．6736，P＝0．0306）。FQ-PCR檢測(cè)陽性的9例中有7例復(fù)發(fā)。

討 論

腦脊液病原體培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)腦的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但結(jié)核患兒腦脊液中由于含菌量低、菌活力低以及L型菌（Mt b的一種細(xì)胞壁缺陷變異型）的出現(xiàn)等細(xì)菌生物學(xué)性狀的改變［6］，很容易漏診，加之培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)，通常4～8周出結(jié)果，且靈敏度低，嚴(yán)重影響了結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療［7］，無法滿足臨床早期診斷結(jié)腦的需要。早期結(jié)腦的病死率不足10%，但晚期可達(dá)60%以上［8］。因此，準(zhǔn)確、快速診斷結(jié)腦是治療和預(yù)后的關(guān)鍵，Deshpande等［3］認(rèn)為PCR是首選，它在結(jié)腦處于非常初期階段就可以診斷［9］。

筆者采用FQ-PCR對(duì)結(jié)腦組和對(duì)照組與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了盲法對(duì)比的研究，各組間年齡、性別、BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），具有可比性。在經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診的117例結(jié)腦患兒中，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)全部為陽性，敏感度為100．0%，非結(jié)腦組（對(duì)照組）檢出1例陽性，特異度為96．7%，靈敏度高于文獻(xiàn)［10-11］的90%和94．4%，特異度低于二者的100．0%。Deshpande等［3］觀察到PCR擴(kuò)增的靈敏度和特異度在臨床標(biāo)本之間差異較大，在不同的實(shí)驗(yàn)室，從50%～90%和60%～100%。作者認(rèn)為上述文獻(xiàn)低靈敏度的原因可能是所選用患者標(biāo)準(zhǔn)不同（本研究所選患者組均為Mtb培養(yǎng)陽性，靈敏度達(dá)100．0%），同時(shí)與PCR方法、探針不同，腦脊液中低負(fù)荷DNA或者細(xì)胞壁堅(jiān)韌目標(biāo)DNA分離困難［12］、腦脊液量不足、腦脊液中存在抑制擴(kuò)增的物質(zhì)［11］、以及細(xì)胞裂解或在純化過程中DNA提取方法不同所致，實(shí)驗(yàn)防污染措施不到位也會(huì)導(dǎo)致特異度降低。FQ-PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)基團(tuán)，Taq Man探針對(duì)目標(biāo)序列特異性高，特別適用于單核苷酸多態(tài)性（SNP）的檢測(cè)［13］，F(xiàn)Q-PCR 全“封閉”式的操作、d UPT-UNG酶防污染體系的設(shè)立，在相當(dāng)?shù)某潭壬辖鉀Q了普通PCR難以避免的實(shí)驗(yàn)污染問題。FQ-PCR熒光檢測(cè)比普通PCR后的電泳檢測(cè)靈敏度要高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)［14］，而傳統(tǒng)的涂片抗酸桿菌染色檢查需每毫升痰標(biāo)本達(dá)到5000～10 000條菌以上才可能檢出［15-16］，培養(yǎng)法的靈敏度可達(dá)10條／ml，但一般需要4～8周才能報(bào)告結(jié)果［16］，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)痰和血標(biāo)本中Mtb靈敏度高達(dá)10-18kg DNA和1～5個(gè)菌體／ml，無疑可以提高方法的靈敏度和特異度，達(dá)到早期診斷的目的。本文所選患兒均為前驅(qū)期結(jié)腦患兒，診斷指數(shù)達(dá)196．7%，符合率為99．3%，陽性預(yù)測(cè)值為99．2%，陰性預(yù)測(cè)值則為100．0%，r＝0．9790，提示 FQ-PCR在診斷性試驗(yàn)評(píng)價(jià)真實(shí)性的診斷效能指標(biāo)和應(yīng)用價(jià)值的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，以及可靠性方面，均取得較佳效果。而文獻(xiàn)［10］靈敏度僅為50%，可能與方法、試劑和患者選擇（患者平均年齡為38歲，60%的患者為男性，而且72%的患者為HIV陽性）有關(guān)。

117例結(jié)腦組患兒治療3周后2種方法同時(shí)檢測(cè)，培養(yǎng)法陽性率為27．35%，F(xiàn)Q-PCR為58．12%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這是因?yàn)樗幬镏委煾淖兞思?xì)菌的生物學(xué)活性，抑制了Mt b生長(zhǎng)，致使陽性率下降；而FQ-PCR檢測(cè)的是Mtb特異性基因片段，只要沒有引起檢測(cè)位點(diǎn)基因突變，理論上都可以檢測(cè)出陽性結(jié)果。因而可以分析出，F(xiàn)Q-PCR法在監(jiān)測(cè)藥物對(duì)Mt b清除效果方面，更符合機(jī)體實(shí)際情況，而且可以精確了解Mt b復(fù)制及含量。

為更進(jìn)一步了解2種方法對(duì)療效和預(yù)后評(píng)估的作用和意義，筆者對(duì)結(jié)腦組出院時(shí)2種方法各自檢測(cè)陰性患兒做了隨訪工作，培養(yǎng)法檢測(cè)陰性78例患兒有7例復(fù)發(fā)，F(xiàn)Q-PCR陰性69例患兒均無復(fù)發(fā)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。78例培養(yǎng)陰性的患兒除了FQ-PCR同為陰性的69例外，還有9例FQ-PCR檢測(cè)陽性，9例中有7例復(fù)發(fā)，2例含量較低的患兒未復(fù)發(fā)。筆者發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)患兒是因?yàn)橹委熜Ч患堰€存在Mtb，而培養(yǎng)法又檢測(cè)不到，誤認(rèn)為治愈所致。提示盡管培養(yǎng)法檢測(cè)陰性，由于本身靈敏度差及其藥物治療的影響，未必腦脊液中就沒有Mtb存在，而FQ-PCR因?yàn)槠涓哽`敏度，在預(yù)后評(píng)估方面更具說服力。

綜上所述，筆者認(rèn)為FQ-PCR檢測(cè)腦脊液Mt b DNA準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，對(duì)早期結(jié)腦診斷、治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，對(duì)療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估比培養(yǎng)法更具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究不足之處在于，文中只分了培養(yǎng)陽性結(jié)腦組和非結(jié)腦組兩組患兒，沒有將培養(yǎng)陰性的結(jié)腦患兒進(jìn)行比較分析，若都計(jì)算在內(nèi)，盡管FQ-PCR陽性率會(huì)降低，但也許更能體現(xiàn)其作用和價(jià)值，這一問題有待今后進(jìn)一步研究探討。

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