實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)兒童肺結(jié)核糞便中Mtb-DNA的效果評(píng)價(jià)

黃慧謙 吳馳 陳建波 楊燕 侯志平 李小勇

2003年WHO估計(jì)，每年全球有1～2億人死于結(jié)核病，其中有30萬15歲以下兒童死于肺結(jié)核。盡管兒童結(jié)核病疫情嚴(yán)峻，但長(zhǎng)期以來，人們往往對(duì)成人結(jié)核病給予更多的關(guān)注，對(duì)于兒童結(jié)核病卻容易忽視。由于兒童患者痰標(biāo)本獲得困難，阻礙了小兒結(jié)核病的診斷。為了獲得臨床細(xì)菌學(xué)檢查標(biāo)本往往需要采用侵入性檢查方法，如采用纖維支氣管鏡（簡(jiǎn)稱“纖支鏡”）誘導(dǎo)痰或用胃鏡吸取胃內(nèi)容物查找抗酸桿菌，這些方法不僅給患兒帶來痛苦，而且也增加了醫(yī)院感染的風(fēng)險(xiǎn)，并且敏感度不高。

本研究收集臨床診斷肺結(jié)核的住院兒童的糞便標(biāo)本，同時(shí)采用熒光探針加聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的檢測(cè)方法，初步建立起了應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR（FQ-PCR）技術(shù)快速檢測(cè)肺結(jié)核患兒糞便標(biāo)本的流程，并對(duì)其臨床效果進(jìn)行初步評(píng)估。

材料和方法

一、標(biāo)本來源與分組

實(shí)驗(yàn)組：收集本院2010年1月至2011年8月間臨床診斷為肺結(jié)核并排除腸結(jié)核病、年齡小于16歲的住院患兒糞便標(biāo)本76例作為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中41例患兒可取得痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)及抗酸桿菌涂片細(xì)菌學(xué)檢查，進(jìn)一步分為15例痰菌陽性肺結(jié)核患兒、26例痰菌陰性肺結(jié)核患兒與35例無痰肺結(jié)核患兒3組。住院患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合下列條件之一：痰或纖支鏡刷片查抗酸菌涂片陽性；或Mtb培養(yǎng)陽性；或其他治療無效，影像學(xué)檢查符合肺結(jié)核病診斷［1］。并正規(guī)抗結(jié)核治療有效，無腸道結(jié)核癥狀與體征，符合肺結(jié)核病演變過程?；純耗挲g最小1個(gè)月，最大16歲，平均年齡（9．91±5．56）歲。其中男性50例，女性26例，男∶女＝1．92∶1。其中臨床診斷為肺結(jié)核住院患兒68例，肺結(jié)核合并胸膜炎或胸腔積液4例，結(jié)核性腦膜炎3例，頸部淋巴結(jié)核1例。

對(duì)照組：取同時(shí)期我院兒科住院的20例其他呼吸系統(tǒng)疾病患兒的糞便標(biāo)本作為對(duì)照組檢測(cè)FQ-PCR，其中男性12例，女性8例，男女比例為1．5∶1，年齡最小4個(gè)月，最大14歲，平均年齡（8．47±4．03）歲，臨床診斷上呼吸道感染患兒4例，肺炎6例，皰疹性咽峽炎10例。

二、方法

1．糞便標(biāo)本預(yù)處理：新鮮糞便標(biāo)本收集在無菌塑料杯中，取回實(shí)驗(yàn)室后置入（4℃）冰箱保存，時(shí)間不超過48h。取500mg糞便標(biāo)本加入裝有2ml無菌PBS緩沖液（0．05mol／L，pH 7．4）的試管中充分振蕩搖勻后，3200×g離心5min，收集上清液，重復(fù)上述PBS洗滌離心步驟1次，最終收集上清液1ml置于1．5ml的eppendorf管中。然后上清液16 400×g離心10min，棄上清后，沉淀加入1ml生理鹽水中重懸混勻，等分為2份后，16 400×g離心10min，棄上清，保留沉淀，一份標(biāo)本置于-30℃冰箱中待抽提DNA，另一份標(biāo)本行涂片檢查。所有標(biāo)本在1h內(nèi)預(yù)處理完畢。

2．試劑盒抽提DNA：糞便標(biāo)本預(yù)處理后采用進(jìn)口試劑盒（QIAGEN公司QIAamp DNA mini kit）快速提取DNA，痰標(biāo)本采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的Mtb核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒提取DNA，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。

3．FQ-PCR檢測(cè) Mtb：Mtb核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。具體操作步驟按照說明書操作。樣本熒光擴(kuò)增曲線根據(jù)說明書進(jìn)行結(jié)果判斷分析。

4．Mtb培養(yǎng)和涂片檢查：痰Mtb培養(yǎng)參照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》［2］，采用法國(guó)梅里埃公司BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)系統(tǒng)，陰性標(biāo)本培養(yǎng)42d，培養(yǎng)陽性標(biāo)本需涂片檢查確認(rèn)。痰、糞便涂片檢查采用金胺O染色，暗視野熒光顯微鏡下檢測(cè)，具體操作參照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》［2］進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件及Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法檢驗(yàn)結(jié)果的比較采用四格表資料分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、糞便標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)的敏感度和特異度

實(shí)驗(yàn)組76例患兒糞便標(biāo)本中檢出Mtb-DNA陽性18例，敏感度為23．68%；對(duì)照組20例其他呼吸系統(tǒng)疾病患兒的糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)Q-PCR結(jié)果均為陰性，特異度為100．00%。

二、糞便標(biāo)本FQ-PCR與金胺O染色檢測(cè)結(jié)果的比較

76例患兒糞便標(biāo)本中，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)，Mtb陽性18例，陽性率23．68%（18／76）；76例患兒糞便標(biāo)本同時(shí)采用金胺O染色涂片檢測(cè)，Mtb陽性5例，陽性率僅為6．58%（5／76）。兩者均為陽性者5例，兩者均為陰性者58例，涂片陰性、FQ-PCR陽性標(biāo)本13例，涂片陽性而FQ-PCR陰性標(biāo)本0例（表1）。FQ-PCR檢測(cè)陽性率明顯高于涂片檢測(cè)，兩種方法采用四格表資料的Fisher確切概率法計(jì)算（累積概率P＝0．00046，P＜0．05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法對(duì)糞便標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的比較（例）

三、痰細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陽性、痰細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陰性與無痰肺結(jié)核患兒的糞便標(biāo)本FQ-PCR結(jié)果的比較

41例患兒同時(shí)進(jìn)行了至少1次以上的痰標(biāo)本的涂片和（或）培養(yǎng)檢測(cè)（其中痰菌陽性患兒15例、痰菌陰性患兒26例），收集患兒糞便標(biāo)本進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)；另有35例患兒未收集到痰標(biāo)本，因此只進(jìn)行了糞便標(biāo)本的FQ-PCR檢測(cè)。如表2所示，痰菌陽性肺結(jié)核患兒組糞便標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果陽性10例，陽性率66．67%（10／15）；痰菌陰性肺結(jié)核患兒組糞便標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果陽性1例，陽性率3．85%（1／26）；無痰肺結(jié)核患兒組糞便標(biāo)本PCR檢測(cè)結(jié)果陽性7例，陽性率20．00%（7／35）。兩兩比較，痰菌陽性患兒與痰菌陰性患兒（χ2＝16．06，P＜0．05）、無痰肺結(jié)核患兒 （χ2＝10．19，P＜0．05）FQ-PCR陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；痰菌陰性患兒與無痰肺結(jié)核患兒FQ-PCR陽性率比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝8．23，P＜0．05）。

表2 痰菌陽性、痰菌陰性肺結(jié)核患兒與無痰肺結(jié)核患兒糞便FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果（例）

四、糞便標(biāo)本與痰標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果的比較

41例兒童肺結(jié)核患兒同時(shí)收集到了糞便和痰標(biāo)本。取同一患兒的糞便和痰標(biāo)本進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)，其結(jié)果如表3所示，糞便標(biāo)本PCR檢測(cè)結(jié)果陽性11例，陽性率26．83%（11／41）；痰標(biāo)本 PCR檢測(cè)結(jié)果陽性18例，陽性率43．90%（18／41）；兩者均為陽性有11例，兩者均為陰性有22例，痰標(biāo)本陰性、糞便PCR陽性標(biāo)本1例，痰標(biāo)本陽性而糞便PCR陰性標(biāo)本8例。兩種方法采用四格表資料χ2檢驗(yàn)的校正公式進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝12．93，P＜0．05）。

表3 同一患者的兩種標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果比較（例）

討 論

全球結(jié)核病疫情發(fā)展迅猛，兒童結(jié)核病發(fā)病率也在增加。長(zhǎng)期以來，兒童結(jié)核病的診斷與治療容易被忽視，兒童結(jié)核病的誤診率極高。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，超過40%的兒童結(jié)核病患者誤診時(shí)間大于30d，誤診時(shí)間大于90d的患者也不鮮見［3］。兒童結(jié)核病診斷較困難最重要的原因之一是，結(jié)核病患兒的臨床標(biāo)本留取困難，細(xì)菌學(xué)檢查的方法陳舊且陽性率低。2000年我國(guó)痰涂片與培養(yǎng)陽性兒童患者不足6萬例，同期據(jù)估算全國(guó)有活動(dòng)性肺結(jié)核病兒童患者45萬例，即大部分結(jié)核病患兒為Mtb細(xì)菌學(xué)檢查陰性［4］。

兒童和嬰兒無法主動(dòng)咯出痰標(biāo)本，本研究實(shí)驗(yàn)組76例兒童肺結(jié)核患者中，只有41例患兒最終收集到了痰標(biāo)本進(jìn)行涂片和（或）培養(yǎng)檢測(cè)。兒童肺結(jié)核患者的痰大部分吞入消化道中，據(jù)此，國(guó)內(nèi)外有報(bào)道通過插胃管吸取胃液標(biāo)本查分枝桿菌，診斷的陽性率可達(dá)20%～40%［5-6］。雖然抽取兒童胃液進(jìn)行細(xì)菌學(xué)或PCR檢查，可提高M(jìn)tb檢出率，但該方法屬于侵入性操作，既增加了患兒的痛苦又對(duì)臨床實(shí)施的各方面要求較高，目前在我國(guó)難以作為兒童肺結(jié)核常規(guī)診斷方法，尤其是不適合用于臨床疑似肺結(jié)核患兒的初步篩查。2008年，Wolf等［7］對(duì)236名懷疑肺結(jié)核的患兒進(jìn)行了大量的侵入性檢查，包括支氣管灌洗和插胃管等，收集到超過2000份臨床標(biāo)本進(jìn)行Mtb培養(yǎng)，最終只有16名患兒培養(yǎng)結(jié)果為陽性，初篩陽性率極低。

2003年，Montenegro等［8］研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者糞便標(biāo)本中可檢測(cè)到Mtb-DNA，說明Mtb核酸經(jīng)過腸道轉(zhuǎn)運(yùn)后仍可保持完整。本研究采用試劑盒快速提取糞便樣本中總DNA和FQ-PCR擴(kuò)增Mtb種屬特異性IS6110核酸片段的方法，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果敏感度達(dá)到23．68%，特異度為100．00%。本研究中，76例糞便標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽性18例，陽性率23．68%，金胺O染色涂片檢測(cè)陽性標(biāo)本5例，陽性率僅為6．58%。糞便標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)陽性率明顯高于涂片檢測(cè)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與2009年El Khéchine等［9］的相關(guān)報(bào)道是一致的。一方面說明了糞便標(biāo)本采用FQ-PCR進(jìn)行檢測(cè)受干擾小，結(jié)果靈敏度較高；另一方面，由于Mtb涂片檢查陽性率低于熒光PCR的檢測(cè)［10］，同時(shí)也由于糞便中雜質(zhì)較多，導(dǎo)致背景干擾較大，進(jìn)一步降低了糞便涂片檢查的陽性率，表明糞便標(biāo)本涂片不適用于臨床查Mtb。

本研究對(duì)痰細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陽性、痰細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陰性與無痰肺結(jié)核患兒的糞便標(biāo)本的FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，還對(duì)同一患兒的糞便標(biāo)本FQPCR檢測(cè)結(jié)果與痰標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，痰菌陽性肺結(jié)核患兒糞便標(biāo)本FQ-PCR陽性率（66．67%）明顯高于痰菌陰性組（3．85%）和無痰患兒組（20．00%）；同一患者的痰標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)陽性率（43．90%）也顯著高于糞便標(biāo)本PCR檢測(cè)陽性率（26．83%），因此，糞便標(biāo)本PCR檢出率高于糞便涂片但低于痰涂片和（或）培養(yǎng)以及痰PCR，比較敏感。但是，76例結(jié)核病患兒中有35例（46．05%）只收集到糞便標(biāo)本，經(jīng)FQPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了陽性7例。因此，雖然痰涂片加培養(yǎng)或者痰PCR檢測(cè)優(yōu)于糞便標(biāo)本PCR檢測(cè)，但糞便標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)兒童結(jié)核病患者痰標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果是一個(gè)有益的補(bǔ)充。

本研究采用試劑盒提取糞便標(biāo)本中DNA，快速高效，減少了糞便中PCR抑制劑對(duì)結(jié)果的干擾；采用FQ-PCR擴(kuò)增技術(shù)，比普通PCR擴(kuò)增加電泳檢查又可大大提高檢測(cè)的靈敏度。糞便檢測(cè)結(jié)果陽性的患兒，不但可避免多次侵入性檢查；而且，整個(gè)操作流程只需5～6h，速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Mtb培養(yǎng)所需的幾個(gè)星期。同時(shí)，保留檢測(cè)結(jié)果陽性的糞便標(biāo)本DNA，還可進(jìn)一步用于利福平、異煙肼等抗結(jié)核藥物的耐藥突變位點(diǎn)的檢測(cè)。這些研究的證據(jù)都表明，糞便標(biāo)本熒光實(shí)時(shí)PCR可以協(xié)助診斷小兒肺結(jié)核病。

總之，糞便熒光實(shí)時(shí)PCR是一種特異度高、中度敏感、非侵入性且相對(duì)安全快速的診斷方法，作為可疑兒童肺結(jié)核患者的一項(xiàng)初篩測(cè)試，可減少兒童結(jié)核病誤診的發(fā)生。隨著DNA提取和PCR擴(kuò)增技術(shù)的不斷改進(jìn)，其檢測(cè)陽性率還可進(jìn)一步提高。由于結(jié)果的高特異度，早期糞便熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)還能幫助臨床醫(yī)生迅速找出肺結(jié)核患兒，并開始進(jìn)行早期治療。

［1］金彪，朱銘．兒童胸部影像學(xué)診斷．第9講 兒童肺結(jié)核的影像診斷．中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2004，19（9）：574-575．

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