卡利比克畢赤酵母活細(xì)胞制劑加工工藝的研究

龐水秀，張紅印，楊其亞，趙利娜

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

卡利比克畢赤酵母活細(xì)胞制劑加工工藝的研究

龐水秀，張紅印*，楊其亞，趙利娜

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

分別對(duì)卡利比克畢赤酵母的活細(xì)胞液體和固體劑型產(chǎn)品的加工工藝進(jìn)行研究。利用磷酸緩沖溶液添加0.01%維生素C和2.5%海藻糖制備的卡利比克畢赤酵母液體制劑在20℃保藏15d仍然保持81.8%存活率。利用微波真空干燥技術(shù)在真空度8kPa，功率先為200W，后為100W，然后再進(jìn)行真空干燥，得到含水量9.4%，活細(xì)胞率為100%的活性干酵母，經(jīng)過(guò)4℃保藏3個(gè)月仍然保持84.8%存活率。無(wú)論采用液體制劑還是固體制劑，在保藏后對(duì)水果的病害仍具有良好的生物防治效果。

生物防治，卡利比克畢赤酵母，液體制劑，固體制劑，微波真空干燥

水果病害一直是水果貯藏的重要課題。盡管目前有高效殺菌劑和先進(jìn)的貯藏技術(shù)，但在發(fā)展中國(guó)家每年因病害造成的水果損失依然高達(dá)50%，即使美國(guó)這樣的發(fā)達(dá)國(guó)家每年也有10%～30%的新鮮產(chǎn)品由于采后病害而導(dǎo)致腐爛。我國(guó)水果采后損失為20%～30%左右［1-2］。防治水果采后病害的傳統(tǒng)方法是使用化學(xué)殺菌劑，但水果上的化學(xué)殺菌劑殘留會(huì)對(duì)人體健康造成影響。使用非化學(xué)的、非選擇性的殺菌劑控制水果采后病害將是以后的發(fā)展方向。近年來(lái)美國(guó)、意大利等發(fā)達(dá)國(guó)家生物防治研究已經(jīng)取得了階段性的成果，生物防治的應(yīng)用潛力巨大，使其可能成為取代化學(xué)殺菌劑的有效方法［3］。本實(shí)驗(yàn)室所篩選的卡利比克畢赤酵母是一種安全無(wú)毒，對(duì)人體無(wú)害，且對(duì)草莓、桃子等水果采后病害具有顯著的防治效果的拮抗酵母。新型水果采后生物防腐保鮮劑作為一種活菌制劑，必須保證成品中有一定數(shù)量的活菌，需要好的活細(xì)胞制劑生產(chǎn)工藝。生物防腐保鮮劑可以制備成固體和液體劑型。其中固體型制劑具有保藏期長(zhǎng)、易于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，因此它是目前活菌制劑的比較流行的劑型。菌體干燥的主要方法有流化床干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等多種方法，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新地應(yīng)用真空微波干燥爐來(lái)制備高活性的活菌制劑。而液體型制劑更方便于使用，因?yàn)槠涔に嚭?jiǎn)單、成本低也就成為了目前的研究熱點(diǎn)。在液體方法保存方面，有研究表明磷酸緩沖液添加海藻糖或者半乳糖能使Candida sake或Pichia anomala保持高活性［4-6］。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上嘗試添加幾種保護(hù)劑制備高活性的液體型制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

拮抗菌 卡利比克畢赤酵母(Pichia caribbica)，由本實(shí)驗(yàn)室分離、篩選于無(wú)公害生態(tài)果園;病原菌葡枝根霉(Rhizopus stolon)，為本實(shí)驗(yàn)室從腐爛水果表面分離得到。

NJ207-型微波真空干燥爐 南京杰全微波設(shè)備有限公司;LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體型制劑的制備方法研究

1.2.1.1 卡利比克畢赤酵母生產(chǎn)培養(yǎng) 采用錐形瓶液體培養(yǎng)基發(fā)酵，在28℃，振蕩速度200r/min下培養(yǎng)48h，所用的錐形瓶大小為1L，培養(yǎng)基裝液量為500mL，初始的菌濃度為104cfu/mL，所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液:牛肉膏8g/L，酵母浸膏5g/L，海藻糖10g/L，115℃，滅菌15min。

1.2.1.2 卡利比克畢赤酵母液體型制劑的制備工藝研究 將培養(yǎng)好的卡利比克畢赤酵母發(fā)酵液裝入離心杯中，4000r/min離心15min，除去上清液，無(wú)菌水清洗，再離心得到菌體沉淀，然后加入0.05mol/L的磷酸緩沖液制成菌懸液，備用。

a.維生素C對(duì)卡利比克畢赤酵母液體型制劑中菌體存活率的影響:使用0.05mol/L的磷酸緩沖液稀釋，并用血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板將備好的溶液中菌體濃度調(diào)至5×108cfu/mL，然后溶液中添加2.5%海藻糖，將酵母懸浮液溶液均勻分裝在六個(gè)錐形瓶中。在每個(gè)錐形瓶中分別添加0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的維生素C，把每瓶溶液均勻分裝在10mL的試管中，每支5mL。然后保存于25℃溫度下。初始的活菌數(shù)是通過(guò)平板計(jì)數(shù)法確定的。在15d后通過(guò)平板計(jì)數(shù)法得出各組的活菌數(shù)，最終得出其存活率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，每次作兩個(gè)平行處理。

b.海藻糖對(duì)卡利比克畢赤酵母液體型制劑中菌體存活率的影響:使用0.05mol/L的磷酸緩沖液稀釋，并用血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板將備好的溶液中菌體濃度調(diào)至5×108cfu/mL，在酵母懸浮液溶液添加0.01%維生素C然后均勻分裝在六個(gè)錐形瓶中。在每個(gè)錐形瓶中分別添加0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%的海藻糖，把每瓶溶液均勻分裝在10mL的試管中，每支5mL。然后保存于25℃溫度下。初始的活菌數(shù)是通過(guò)平板計(jì)數(shù)法確定的。在15d后通過(guò)平板計(jì)數(shù)法得出各組的活菌數(shù)，最終得出其存活率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，每次作兩個(gè)平行處理。

1.2.1.3 儲(chǔ)藏后卡利比克畢赤酵母液體型制劑的生防效果研究

a.生防效果:用打孔器在草莓赤道的部位打1個(gè)直徑3mm深3mm的傷口，每個(gè)草莓打2個(gè)傷口。按要求用移液器分別加入儲(chǔ)藏后的酵母制劑(稀釋到1×108cfu/mL)和新鮮酵母懸液(濃度1×108cfu/mL) 30μL，無(wú)菌蒸餾水作為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。常溫下放置2h，分別把30μL葡枝根霉(Rhizopus stolon)孢子菌懸液(濃度為5×103個(gè)/mL)接種到傷口上。經(jīng)過(guò)上述處理的草莓有序地放置在塑料筐里，并用保鮮膜進(jìn)行密封，以保持筐內(nèi)濕度。然后儲(chǔ)存在20℃下，2d后測(cè)定由葡枝根霉引起的草莓果實(shí)發(fā)病率。每組實(shí)驗(yàn)用15個(gè)果實(shí)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

b.生長(zhǎng)動(dòng)態(tài):用打孔器在草莓赤道的部位打1個(gè)直徑3mm深3mm的傷口。按要求用移液槍分別加入儲(chǔ)藏后的酵母制劑(稀釋到1×108cfu/mL)和新鮮酵母懸液(濃度1×108cfu/mL)30μL，將草莓置于塑料籃子中，用保鮮膜進(jìn)行密封，以保持筐內(nèi)濕度。然后儲(chǔ)存在20℃下，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)定水果傷口處的卡利比克畢赤酵母數(shù)。

水果傷口處的卡利比克畢赤酵母數(shù)測(cè)定方法為:在酒精燈火焰下挖下傷口，放入裝有50mL無(wú)菌水的錐形瓶中，用無(wú)菌玻璃棒打碎水果傷口部分，使其均勻分布于溶液中。將溶液用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，分別用移液器取0.1mL注在NYDA培養(yǎng)基平板上，用滅過(guò)菌的涂布棒涂布均勻，置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，取出，數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算每個(gè)水果傷口的卡利比克畢赤酵母數(shù)。

1.2.2 固體型制劑的制備方法研究

1.2.2.1 卡利比克畢赤酵母生產(chǎn)培養(yǎng) 同1.2.1.1。

1.2.2.2 微波真空干燥卡利比克畢赤酵母 取發(fā)酵后菌液4000r/min離心10min，棄上清液，無(wú)菌水反復(fù)清洗2次，獲得酵母乳液。司班60用80～90℃的熱水配制，可按每100mL水里加12.5g配制，配好后保持65～70℃，按2%(w/w)的添加量加入酵母乳中，并保證混合均勻。稱取卡利比克畢赤酵母乳液96.16g，放入微波爐專用塑料盒，真空度8kPa。

a.200W微波功率干燥26min，過(guò)程中待含水量少于40%時(shí)，取出物料將其打散，以免干燥后結(jié)成硬塊，然后繼續(xù)干燥。

b.100W微波功率干燥54min，過(guò)程中待含水量少于40%時(shí)，取出物料將其打散，以免干燥后結(jié)成硬塊，然后繼續(xù)干燥。

c.200W微波功率干燥12min，100W微波功率干燥16min，至含水量24.6%，然后改用真空干燥，干燥溫度30～35℃，干燥時(shí)間2h。

活細(xì)胞率的計(jì)算:稱取5g未干燥的菌泥融入200mL的自來(lái)水中，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法得到其總的活細(xì)胞數(shù)為N1(cfu/mL);將干燥后菌粉融入200mL的自來(lái)水中，然后37℃的水浴鍋中復(fù)水活化0.5h，同樣通過(guò)平板計(jì)數(shù)法得到其總的活細(xì)胞數(shù)N2(cfu/mL)。活細(xì)胞率(%)=N2/N1×100%。

1.2.2.3 微波真空干燥卡利比克畢赤酵母儲(chǔ)藏期活性及生防效果的測(cè)定 每隔1個(gè)月稱取一定量(約1g)的卡利比克畢赤酵母酵母干粉，將干燥后菌粉融入200mL的自來(lái)水中，然后37℃的水浴鍋中復(fù)水活化0.5h，梯度稀釋，用移液器取100μL涂平板，28℃下培養(yǎng)48h，菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算每g卡利比克畢赤酵母干粉中的活菌數(shù)目。

用打孔器在桃子赤道的部位打1個(gè)直徑3mm深3mm的傷口，每個(gè)桃子打2個(gè)傷口。按要求用移液器分別加入儲(chǔ)藏后的復(fù)活的酵母干粉制劑(稀釋到1×108cfu/mL)和新鮮酵母懸液(濃度1×108cfu/mL) 30μL，無(wú)菌蒸餾水作為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。常溫下放置2h后，分別把30μL葡枝根霉孢子菌懸液(濃度為5×103個(gè)/mL)接種到傷口上。經(jīng)過(guò)上述處理的桃子有序地放置在塑料筐里，并用保鮮膜進(jìn)行密封，以保持筐內(nèi)濕度。然后儲(chǔ)存在25℃下，2d后測(cè)定果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。每組實(shí)驗(yàn)用15個(gè)果實(shí)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 維生素C對(duì)卡利比克畢赤酵母液體型制劑中菌體存活率的影響Table 1 Thalli survival rate of Pichia caribbica liquid formulation with VC

表2 海藻糖對(duì)卡利比克畢赤酵母液體型制劑中菌體存活率的影響Table 2 Thalli survival rate of Pichia caribbica liquid formulation with trehalose

表3 卡利比克畢赤酵母對(duì)草莓葡枝根霉的抑制效果Table 3 Inhibition effect of Pichia caribbica on Rhizopus stolon

2 結(jié)果與分析

2.1 液體型制劑制備方法的研究

2.1.1 維生素C對(duì)卡利比克畢赤酵母液體型制劑中菌體存活率的影響 從表1可以看出，添加不同的維生素C的卡利比克畢赤酵母在保存后各組之間的細(xì)胞存活率差異不明顯。但是不添加維生素C的細(xì)胞存活率明顯低于處理組(P＜0.05)。

維生素C又叫L-抗壞血酸，是一種水溶性維生素，酸性，具有較強(qiáng)的還原性。有報(bào)道表明天然抗氧化物質(zhì)包括維生素C能通過(guò)一定程度抑制微生物的新陳代謝從而減緩微生物的生長(zhǎng)［7］，這大概是維生素C能改善卡利比克畢赤酵母液體型制劑在保藏期間的細(xì)胞存活率的原因。

2.1.2 海藻糖對(duì)卡利比克畢赤酵母液體型制劑中菌體存活率的影響 從表2可以看出，添加2.5%海藻糖的卡利比克畢赤酵母的存活率達(dá)到82%，明顯高于其他各組，其中沒(méi)有添加海藻糖組的卡利比克畢赤酵母的存活率僅有31.28%。

海藻糖是一種非還原性二糖，廣泛存在于各種生物體內(nèi)的抗逆境劑。海藻糖具有穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu)和提高生物組織對(duì)逆境條件下的抗性［8］。因此，把海藻糖作為卡利比克畢赤酵母在液體型制劑中的保護(hù)劑，可減少酵母細(xì)胞在液體中保藏時(shí)受到外界不良因素的影響。其作用機(jī)理可能是:海藻糖不直接與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用，而是優(yōu)先與水結(jié)合，使它們從蛋白質(zhì)分子中的溶劑化層中排除出來(lái)，導(dǎo)致酶的溶劑化層半徑減少，蛋白質(zhì)的表觀體積減小，可移動(dòng)性降低，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更趨緊密，構(gòu)象更穩(wěn)定，從而抵御外界極端環(huán)境的影響。

2.1.3 儲(chǔ)藏后卡利比克畢赤酵母液體型制劑的生防效果研究 從表3可以看出，保存后的卡利比克畢赤酵母和新鮮的卡利比克畢赤酵母都對(duì)草莓的葡枝根霉具有明顯的抑制效果，而且兩者沒(méi)有明顯的差異(P＞0.05)，說(shuō)明了卡利比克畢赤酵母在保存過(guò)程中其生防效果沒(méi)有受到影響。

從圖1中可以看出，保存后的卡利比克畢赤酵母和新鮮的卡利比克畢赤酵母在20℃下培養(yǎng)能在草莓傷口處快速地生長(zhǎng)。研究表明營(yíng)養(yǎng)空間的競(jìng)爭(zhēng)是拮抗酵母抑制致病霉菌的一種非常重要的方式［9］，因此，保存后的卡利比克畢赤酵母和新鮮的卡利比克畢赤酵母在草莓傷口處生長(zhǎng)沒(méi)有明顯差異同樣表明它們的生物防治效果沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。

圖1 卡利比克畢赤酵母在草莓傷口處的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.1 The growth dynamic of Pichia caribbica in the cut of strawberry

2.2 固體型制劑制備方法研究

2.2.1 卡利比克畢赤酵母干粉制備 按照上述步驟實(shí)驗(yàn)，得到匯總結(jié)果見表4。

表4 利用微波真空爐制備卡利比克畢赤酵母活性干粉Table 4 Pichia caribbica active dry powder prepared by microwave vacuum furnace

綜上實(shí)例所述，干燥所得產(chǎn)品的活細(xì)胞率隨著水分含量的減少而降低，其影響因素，一方面是水分含量越低，干燥和復(fù)水過(guò)程中活性的損失就越大;另一方面，由于水分的大量減少，物料的介電損耗減少，吸收微波能也減少，不被水分吸收的微波能就會(huì)影響酵母的細(xì)胞膜及其核酸，從而影響細(xì)胞活性。由于本實(shí)驗(yàn)方法同時(shí)具用傳熱效率和干燥速率的優(yōu)勢(shì)，可以考慮將本方法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合，在保持傳統(tǒng)方法高活性優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，也能大大提高生產(chǎn)效率。

2.2.2 微波真空干燥卡利比克畢赤酵母儲(chǔ)藏期活性

從圖2中可以看出，通過(guò)對(duì)經(jīng)過(guò)微波真空干燥的卡利比克畢赤酵母固體制劑保藏的研究表明，卡利比克畢赤酵母在3個(gè)月內(nèi)的活性可以保持在儲(chǔ)藏前的80%以上?？ɡ瓤水叧嘟湍父煞圪A藏在4℃的條件下，可以在3個(gè)月內(nèi)保持良好的生物活性。

圖2 卡利比克畢赤酵母活性干酵母儲(chǔ)藏期內(nèi)的活性變化Fig.2 The activity of Pichia caribbica active dry powder during storage

2.2.3 卡利比克畢赤酵母活性干酵母儲(chǔ)藏期后生防效果研究 從表5可以看出，卡利比克畢赤酵母固體制劑與新鮮制備組比較發(fā)病率及腐爛半徑無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與對(duì)照組相比差異顯著。對(duì)于桃子采后根霉病的腐爛發(fā)病率的影響顯著低于對(duì)照組的發(fā)病率，都具有良好的生防效果。

表5 微波真空干燥卡利比克畢赤酵母儲(chǔ)藏期后對(duì)桃子葡枝根霉的抑制效果Table 5 Inhibition effect of Pichia caribbica active dry powder on Rhizopus stolon in peach after storage

3 結(jié)論

酵母活細(xì)胞制劑加工工藝對(duì)微生物制劑產(chǎn)品的壽命、使用后的生長(zhǎng)和生存能力、操作和應(yīng)用的簡(jiǎn)便性以及成本等都有重要影響。與其他微生物制劑相比，應(yīng)用于防治水果采后病害的微生物劑型研究相對(duì)滯后。

拮抗菌的商業(yè)化能否成功很大程度取決于拮抗菌產(chǎn)品的貨架期以及拮抗菌產(chǎn)品是否保持生防效果。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論顯示，利用磷酸緩沖溶液添加0.01%維生素C和2.5%海藻糖作為保護(hù)劑制備的卡利比克畢赤酵母液體制劑和利用微波真空干燥技術(shù)(真空度8kPa，功率先為200W，后為100W，然后再進(jìn)行真空干燥)制備的活性干酵母均能在貨架期內(nèi)保持高活率以及生防效果。說(shuō)明液體制劑和固體制劑都可以作為卡利比克畢赤酵母活細(xì)胞制劑的商業(yè)化產(chǎn)品的形式。微波真空干燥技術(shù)應(yīng)用于酵母活細(xì)胞制劑的制備對(duì)于提高生產(chǎn)率和降低能耗具有重要意義。

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Study on the processing of active cells agents of Pichia caribbica

PANG Shui-xiu，ZHANG Hong-yin*，YANG Qi-ya，ZHAO Li-na
(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China)

The processing of active cells agents of Pichia caribbica in liquid and solid formulation was investigated. When 0.01%L-ascorbic acid and 2.5%trehalose were used as protectants，Pichia caribbica maintained high vibility of 81.8%after 15d at 20℃.When using microwave vacuum drying，with the vacuum 8kPa，and the power of 200W followed by 100W，Pichia caribbica in solid formulation with high viability of 100%and 9.4%water content was produced.And Pichia caribbica in solid formulation maintained high viability of 84.8%after 3 months at 4℃. Biocontrol efficiencies of Pichia caribbica in liquid and solid formulation were maintained after storage.

biocontrol;Pichia caribbica;liquid formulation;solid formulation;microwave vacuum drying

Q815

B

1002-0306(2012)02-0303-04

2011-03-30 *通訊聯(lián)系人

龐水秀(1984-)，男，碩士研究生，研究方向:食品微生物學(xué)。

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2009214);江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程。