NADPH氧化酶參與機械牽張大鼠血管平滑肌細胞MCP-1mRNA的生成

孫廣萍，于李汀，邊曉慧，楊旭，王艷秋，李德天

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 1 1 0 0 0 4）

以往的研究［1］證實，體內(nèi)血液流動可對血管壁產(chǎn)生3種主要的力學刺激：（1）由血液流動時對血管壁的摩擦力產(chǎn)生的方向沿血管長軸的切應力；（2）由血壓產(chǎn)生的作用于血管壁上的周期性牽張力；（3）由血流靜水壓力產(chǎn)生的作用于血管壁上的壓力。已有研究報道［2］高血壓患者其血管壁的周期性牽張力增大，而且實驗研究［3］也發(fā)現(xiàn)模仿體內(nèi)高血壓狀態(tài)的周期性機械牽張力會誘導血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs） 產(chǎn) 生 炎 性 因子——單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），從而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展，由此提示高血壓時對血管壁產(chǎn)生的機械牽張力對血管壁的炎癥以及動脈粥樣硬化有著非常重要的作用。但是這種機械力如何引起動脈壁炎癥的機制尚不明確。本研究利用Flexcell 3000系統(tǒng)對培養(yǎng)在BioFlex 6孔培養(yǎng)皿中的大鼠主動脈平滑肌細胞給予周期性機械牽張力，觀察機械牽張能否引起大鼠VSMCs表達MCP-1mRNA，并進一步探討NADPH氧化酶在此過程中的作用，明確氧化應激是否參與機械牽張作用下的炎性因子MCP-1 mRNA的表達。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

覆有膠原Ⅰ的硅酮彈力膜的BioFlex 6孔培養(yǎng)盤及Flexercell 3000生物反應系統(tǒng)，購于美國Flexcell公司；亞細胞蛋白質(zhì)組提純試劑盒，購于德國Calbiochem公司；RIPA裂解液、HRP偶聯(lián)的抗山羊抗體、兔抗大鼠Na+/K+ATP酶抗體，均購于美國Cell Signalling Technology公司；Trizol總RNA提取試劑盒、SuperScript First-Strand Synthesis System，購于美國 Invitrogen公司；LC-Fast Start DNA Master SYBR GreenⅠ，購于德國羅氏公司；TaqMan Gene Expression Assay kit，購于美國 Applied Biosystems公司；山羊抗大鼠p47phox抗體，購于美國Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶，均購于美國GIBCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：采用酶消化法［4］進行成年SD大鼠主動脈平滑肌細胞原代培養(yǎng)并傳代。

1.2.2 細胞牽張：采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液進行VSMCs培養(yǎng)。5~12代的VSMCs接種于覆有膠原Ⅰ的BioFlex 6孔培養(yǎng)盤，使得細胞密度保持在1×105/孔，當細胞生長接近融合時，換用含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細胞處于靜止狀態(tài)。將6孔培養(yǎng)盤中的細胞隨機分為對照組（C組）、機械牽張組（ST組）和機械牽張+二苯基氯化碘鹽預處理組（ST+DPI組）。ST組和ST+DPI組在進行機械牽張前1 h分別加入等量的DMEM培養(yǎng)液或DPI（NADPH氧化酶抑制劑，終濃度為10 μmol/L），然后將培養(yǎng)盤固定于Flexercell 3000生物反應系統(tǒng)的底盤上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，通過連接于培養(yǎng)箱外電腦控制的負壓裝置對培養(yǎng)盤的硅酮彈力膜進行周期性負壓牽張，使附著于硅酮彈力膜上的細胞變形。本實驗設(shè)置牽張頻率60次/min、20%的縱向變形以模擬高血壓對血管壁的牽張作用。C組細胞除不接受機械牽張外，余實驗條件同ST組和ST+DPI組。

1.2.3 實時PCR法測定MCP-1mRNA：機械牽張停止后采用TRIzol總RNA提取試劑盒抽提細胞內(nèi)總RNA，采用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的純度。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按LCFast Start DNA Master SYBR GreenⅠ操作規(guī)程進行實時PCR。在PCR總反應體系中同時加入目標基因的引物對與GAPDH引物混合物，在擴增目標基因的同時擴增GAPDH作為內(nèi)對照。MCP-1的引物序列：上游引物：5′-TGTCCCAAAGAAGCTGT AGTATTTGT-3′，下游引物：5′-TTCTGATCTCACTTG GTTCTGGTC-3′，擴增片段為120 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-ACTGAGCATCTCCCTCACAATTC′-3′，下 游 引 物 ：5′-TGCAGCGAACTTTATTGATGGTAT-3′，擴增產(chǎn)物長 1 307 bp。

1.2.4 光澤精化學發(fā)光法測定超氧陰離子：3組給予不同處理因素的細胞分別經(jīng)過胰蛋白酶消化后，4℃、1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入冰冷的PBS緩沖液溶解沉淀，使細胞數(shù)保持1×105/mL。然后將細胞懸液加入光電讀數(shù)器中，加入光澤精5 μmol/L（終濃度）啟動反應，每15 min測1次，每次測量時間為15 s，化學發(fā)光反應以counts/（min·104cells）表示。

1.2.5 Western blot檢測細胞膜p47phox：按照亞細胞蛋白組提取試劑盒的方法提取膜蛋白，上清液加入RIPA裂解液，BCA法測定蛋白濃度，加入6×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃加熱變性5 min；每份樣本取10 μg膜蛋白，用8%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；蛋白質(zhì)用BioRad公司的電轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；一抗為1∶1 000稀釋的山羊抗大鼠p47phox抗體，4℃孵育16 h；二抗為1∶2 000稀釋的HRP標記的抗山羊IgG，室溫孵育1 h。應用ECL+化學發(fā)光試劑在X線膠片上曝光，顯影。洗膜后應用兔抗大鼠Na+/K+ATP酶抗體為一抗作為內(nèi)參檢測同等加樣量。

1.2.6 統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 機械牽張力作用下不同時間點MCP-1mRNA的表達

20%的機械牽張力在1~48 h都明顯增加了VSMCs表達MCP-1mRNA，與未進行機械牽張時比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中6~12 h時MCP-1mRNA表達最強，并且至48 h一直持續(xù)高水平表達。見圖1。

2.2 機械牽張力及DPI對MCP-1mRNA表達、超氧陰離子及膜蛋白p47phox表達的影響

與C組比較，ST組周期性機械牽張力顯著增加VSMCs中MCP-1mRNA的表達（約是C組的15倍）、超氧陰離子的產(chǎn)生量和膜蛋白p47phox的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與ST組比較，ST+DPI組加用NADPH氧化酶抑制劑DPI，明顯減少周期性機械牽張力作用下的VSMCs中MCP-1 mRNA的表達、超氧陰離子的產(chǎn)生量和膜蛋白p47phox的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表 1，圖 2。

3 討論

眾所周知，高血壓是動脈粥樣硬化的易患因素，尤其在血管分叉處，血液流速快，易產(chǎn)生湍流，對血管壁的牽張壓力大，病理解剖也往往發(fā)現(xiàn)此處動脈粥樣斑塊的發(fā)生概率高且嚴重。近年來發(fā)現(xiàn)炎性反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用［5］，其中MCP-1作為一種炎性因子，能使血液中的單核細胞遷入內(nèi)膜下活化為巨噬細胞，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，在動脈粥樣硬化的早期起著重要作用。同時，在動脈粥樣硬化發(fā)生后期，MCP-1對于促進斑塊的不穩(wěn)定也發(fā)揮著作用。MCP-1不僅來源于炎性細胞，在高血壓狀態(tài)下動脈壁也會產(chǎn)生MCP-1。大量的研究［6］表明，患有高血壓的人或?qū)嶒瀯游锲鋭用}壁的MCP-1的表達均增高，尤其在粥樣斑塊的部位MCP-1表達量增高明顯；體外應用Flexcell力學加載系統(tǒng)對培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞進行機械牽張以模擬高血壓狀態(tài)對血管壁的力學牽張作用的實驗研究也表明，周期性機械牽張能誘使血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞產(chǎn)生MCP-1。同樣，本實驗也證明20%的周期性機械牽張力的加載使大鼠VSMCs表達MCP-1mRNA增加，且在6~12 h時表達量最多，說明高血壓能通過誘導血管壁的VSMCs產(chǎn)生MCP-1進而產(chǎn)生炎性反應。

表1 3組細胞超氧陰離子含量、MC P-1mR N A及膜蛋白p 4 7 p h o x表達T a b.1 P r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e i o n a n d e x p r e s s i o n o fMC P-1mR N Aa n d me mb r a n o u s p 4 7 p h o x i n d i f f e r e n t g r o u p s

越來越多的資料表明，活性氧自由基（reactive oxysen series，ROS）在高血壓誘導的動脈粥樣硬化中起到重要作用［7］。無論在高血壓人群還是高血壓動物模型中ROS的產(chǎn)生均增加。增高的ROS一方面直接使內(nèi)皮細胞損傷、內(nèi)膜屏障作用減弱、血脂浸潤，同時激活內(nèi)皮細胞，釋放內(nèi)皮素，表達黏附分子；另外單核細胞被ROS激活后，可通過核因子κB的激活誘導諸如腫瘤壞死因子、白介素等多種細胞因子的表達。細胞因子誘導巨噬細胞和內(nèi)皮細胞進入內(nèi)皮層，氧化低密度脂蛋白，后者被巨噬細胞膜上的清道夫受體識別，進行不受負反饋調(diào)節(jié)的攝取，脂質(zhì)過度積聚，平滑肌細胞在ROS的間接作用下遷移、增生，形成泡沫細胞，最終導致動脈粥樣硬化形成。

ROS除來源于炎性細胞外，近年來發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞也能在高血壓等多種致病因素的作用下產(chǎn)生ROS，而且血管壁的NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起到關(guān)鍵作用［8，9］。已知血管平滑肌細胞NADPH氧化酶是由質(zhì)膜結(jié)合亞基Nox-2或Nox-4、p22phox以及胞質(zhì)調(diào)節(jié)亞單位p47 phox、小GTP酶結(jié)合蛋白Rac組裝成的一種高度調(diào)節(jié)的多亞基氧化酶復合體［9］。失活狀態(tài)的NADPH氧化酶，其胞質(zhì)存在的調(diào)節(jié)亞基與胞膜結(jié)合亞基是分離的，當在刺激因子作用下，NADPH氧化酶的活化依賴于胞質(zhì)調(diào)節(jié)亞基p47 phox轉(zhuǎn)位至胞膜與結(jié)合亞基相結(jié)合?；罨腘ADPH氧化酶以NADPH為底物產(chǎn)生超氧陰離子，后者再進一步間接促進H2O2產(chǎn)生。那么在高血壓狀態(tài)下，增高的機械牽張力能否通過誘導VSMCs的NADPH氧化酶活化產(chǎn)生超氧陰離子并進一步上調(diào)MCP-1mRNA？既往的研究表明，周期性機械牽張力的加載能通過上調(diào)Nox-2及p22phox蛋白及mRNA的表達，也能通過增加p47 phox膜轉(zhuǎn)位活化NADPH氧化酶，從而增加超氧陰離子的產(chǎn)生［10］。本實驗表明，20%的機械牽張力的加載使VSMCs的胞膜p47 phox表達增加，超氧陰離子產(chǎn)生增加，12 h后MCP-1mRNA表達明顯增加，而在加載機械牽張力前1 h加入NADPH氧化酶抑制劑DPI與VSMCs共孵育明顯減少胞膜p47 phox表達，抑制了超氧陰離子產(chǎn)生，12 h后MCP-1mRNA表達明顯下調(diào)，由此說明高血壓所帶來的對血管壁增高的機械牽張作用能通過增加VSMCs胞質(zhì)調(diào)節(jié)亞基p47 phox的膜轉(zhuǎn)位來活化NADPH氧化酶，使得原位超氧陰離子產(chǎn)生增多，進一步增加MCP-1mRNA表達，由此進一步證明氧化反應介導了高血壓對血管壁造成的炎性反應，也提示我們在降壓治療的基礎(chǔ)上，抗氧化治療也為防治高血壓引起的血管壁的炎性反應提供了可能的治療靶點和途徑。

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