新基因JDP2通過(guò)不同通路抑制人胰腺癌上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的研究

許元鴻，劉哲，郭克建，杜瑞霞，蔣紅軍

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胰腺外科，沈陽(yáng) 1 1 0 0 0 1；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽(yáng) 1 1 0 0 2 4；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬奉天醫(yī)院 放射線科，沈陽(yáng) 1 1 0 0 2 4）

在美國(guó)，胰腺癌在各種癌癥死因中列第四位。其早期診斷困難，對(duì)化療及其他療法相對(duì)不敏感，5年生存率僅為3%~5%［1］。進(jìn)一步解析胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)胰腺癌的診斷和治療將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

Jun二聚化蛋白2（Jun dimerization protein 2，JDP2），是以轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白1（activator protein-1，AP-1）成員之一的c-Jun的結(jié)合蛋白被分離出來(lái)［2］，由163個(gè)氨基酸組成，并含有一個(gè)亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）結(jié)構(gòu)。在53例取自7種不同類(lèi)型惡性腫瘤的標(biāo)本中，JDP2的表達(dá)水平在35.8%的癌組織標(biāo)本中呈不同程度的下降，而只有在5.8%的樣品顯示相反的結(jié)果［3］。目前越來(lái)越多的研究證明JDP2是一種新的抑癌因子。其可以通過(guò)多種途徑抑制惡性腫瘤早期的侵襲和轉(zhuǎn)移。

上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）自20余年前被提出以來(lái)，一直受到廣泛的關(guān)注。經(jīng)典的誘導(dǎo)EMT的因子為T(mén)GF-β，另外還有表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等。EMT使細(xì)胞失去極性，丟失細(xì)胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤(rùn)性和游走遷移能力。目前已經(jīng)在乳腺癌、口腔鱗癌、肝癌、胰腺癌等多種癌癥中得到證明［4~7］。

在本研究中，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染JDP2后的胰腺癌細(xì)胞系BxPC3可以抑制由collagen I及TGF-β1誘導(dǎo)形成的EMT。以此證明，作為抑癌因子的JDP2可以通過(guò)多種途徑對(duì)于胰腺癌的EMT起到抑制作用，這種抑制作用，極可能成為新的研究胰腺癌的靶點(diǎn)和方向。由此我們推測(cè)JDP2可能通過(guò)多種途徑對(duì)EMT起到抑制作用。

1 材料與方法

1.1 抗體和生長(zhǎng)因子

兔抗羊E-cadherin、vimentin單克隆抗體及兔抗羊JDP2多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；TGF-β1購(gòu)自Repro tech公司；Collagen I購(gòu)自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，2 d換液1次，3~4 d傳代1次。表達(dá)JDP2質(zhì)粒pCEFL-HA-JDP2由以色列Ami Aroheim教授饋贈(zèng)（The Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences，Technion-Israel Institute of Technology，Israel）。當(dāng)細(xì)胞在 6 孔板上培養(yǎng)達(dá)到70%~80%融合時(shí)，用lipofectamine 2000將pCEFL-HA-JDP2或pCEFL-質(zhì)粒按照說(shuō)明書(shū)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至BxPC3細(xì)胞中，48 h后，轉(zhuǎn)染pCEFL-HAJDP2及pCEFL-質(zhì)粒的BxPC3細(xì)胞酶消化法傳代至已鋪好collagen I的6孔板中，另一組在已轉(zhuǎn)染pCEFL-HA-JDP2及pCEFL-質(zhì)粒的BxPC3細(xì)胞中加入 TGF-β1（10 ng/mL）誘導(dǎo) 7 d；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 Western blot檢測(cè)

Western blot蛋白印跡檢測(cè) JDP2、E-cadherin、Vimentin表達(dá)：嚴(yán)格按照RIPA蛋白裂解液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各組蛋白的提取，將蛋白與5×蛋白上樣緩沖液以4∶1混合后煮沸變性5 min，置于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上之后，用5%脫脂奶粉配置的TBST室溫封閉 2 h，加入 JDP2（1∶600）、E-cadherin（1∶800）、vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 500）一抗后4℃封閉過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫2 h，TBST 洗膜，5 min×4 次，化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell小室上室鋪 50 μL（100mg/L）Matrigel生物膠，下室中加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μL。所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均調(diào)整密度為2×105/孔，種于小室上室。放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)，任意選取5個(gè)視野，以其平均細(xì)胞數(shù)為侵襲至膜上的細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，求取平均數(shù)為結(jié)果。

1.5 免疫熒光觀察

所有細(xì)胞均用PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，5%BSA室溫封閉1 h，之后用E-cadherin、vimentin相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次后，用FITC-或TRITC-標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料均采用x±s表示。采用SPSS13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析；P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染JDP2可以抑制細(xì)胞形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)變

與空白對(duì)照組相比，僅僅轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的Bx－PC3細(xì)胞在Collagen I誘導(dǎo)48 h或TGF-β1誘導(dǎo)7 d后形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，大多數(shù)細(xì)胞變成梭形，細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接喪失（圖1C、F）。經(jīng)轉(zhuǎn)染JDP2的BxPC3細(xì)胞再被Collagen I誘導(dǎo)48 h或TGF-β1誘導(dǎo)7 d后，僅少量細(xì)胞變成梭形，細(xì)胞間緊密連接喪失不明顯（圖1B、E）。接下來(lái)分別將空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒并用Collagen I誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)染JDP2并用Collagen I誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒并用TGF-β1誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)染JDP2 并用 TGF-β1 誘導(dǎo)簡(jiǎn)稱(chēng)為：B、B-V-C、B-J-C、BV-T、B-J-T。

2.2 相比B-J-C與B-J-T細(xì)胞，B-V-C與B-V-T細(xì)胞vimentin表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞侵襲能力增加

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染JDP2的BxPC3細(xì)胞是否能夠改變EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，應(yīng)用Western blot檢測(cè)vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)。結(jié)果證明與空白對(duì)照組相比，B-J-C及B-J-T細(xì)胞E-cadherin、vimentin表達(dá)變化均不顯著（圖2b，圖3b）；B-V-C及B-V-T細(xì)胞vimentin蛋白表達(dá)升高，E-cadherin蛋白表達(dá)降低（圖2b，圖3b）；我們同時(shí)應(yīng)用免疫熒光驗(yàn)證vimentin、E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果證明B-V-C及BV-T細(xì)胞vimentin表達(dá)升高（圖2a，圖3a）而E-cadherin的表達(dá)明顯降低（圖2a，圖3a）。細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)證明B-J-C及B-J-T組細(xì)胞侵襲能力亦明顯小于B-V-C 及 B-V-T組細(xì)胞（P＜0.05）（圖2c，圖 3c）。以上均證明，JDP2高表達(dá)細(xì)胞能夠明顯抑制由Collagen I及TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMT。

3 討論

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、治療效果及預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤，其5年生存率僅為3%~5%［8］，轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者的主要死因。聯(lián)合放化療雖然可以改善生存率［11］，但是由于早期出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移及無(wú)特異癥狀等原因造成其預(yù)后極差。EMT和包括胰腺癌在內(nèi)的腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7，9，10］。最新在《Cell》上發(fā)表的研究結(jié)果表明，老鼠胰腺癌模型的胰腺細(xì)胞在PanIN（pancreatic intraepithelial neoplasia）期就已發(fā)生EMT，上皮間質(zhì)化的細(xì)胞具有高侵襲和轉(zhuǎn)移能力［12］。因此，研究胰腺癌EMT的分子機(jī)制將對(duì)我們發(fā)現(xiàn)控制胰腺癌轉(zhuǎn)移的方法從而提高胰腺癌患者的生存率具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子JDP2是AP-1類(lèi)的抑制因子之一，而AP-1是由Jun、Fos或ATF等家族成員構(gòu)成的異源二聚體，其功能涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，細(xì)胞分化，凋亡及腫瘤的發(fā)生等方面。作為含有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，JDP2可與自身或者與 c-Jun、JunB、JunD或ATF-2等形成二聚體，抑制c-Jun、c-Fos、ATF-2和cyclin-A2等癌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，提示JDP2是一種廣泛的 AP-1 抑制因子［2，13，14］。除轉(zhuǎn)錄抑制活性外，JDP2可與孕酮受體（progesterone receptor，PR）結(jié)合增加PR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性［15］，還可與CHOP10結(jié)合促進(jìn) TRE（TPA response element）依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄［16］。這些結(jié)果說(shuō)明JDP2具有抑制和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的雙重功能，因此，對(duì)腫瘤的作用也可能具有雙重性。Heinrich等發(fā)現(xiàn)JDP2可抑制Ras誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和荷瘤鼠瘤的形成，而且在7種不同類(lèi)型惡性腫瘤中，JDP2的表達(dá)水平呈不同程度下降，提示JDP2具有抑癌作用［3］。然而有學(xué)者通過(guò)病毒插入突變技術(shù)在鼠淋巴瘤模型中篩查出若干候選癌基因，其中包括 JDP2［17，18，19］。另外在肝癌轉(zhuǎn)基因鼠模型中，JDP2過(guò)表達(dá)顯著提高死亡率，增大腫瘤的體積，提示JDP2也有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用［20］。因此，在不同腫瘤中JDP2的表達(dá)可能升高或下調(diào)，并通過(guò)與不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮不同的作用，但其在腫瘤過(guò)程中被調(diào)控以及作用機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步探討。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先應(yīng)用Collagen I或TGF-β1誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)染pCEFL-HA-JDP2或pCEFL-空質(zhì)粒的胰腺癌細(xì)胞系BxPC3。我們發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，空白質(zhì)粒組細(xì)胞明顯變成長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間緊密連接喪失，vimentin蛋白表達(dá)水平顯著升高；而細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)中，E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞的transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示其侵襲能力顯著增高。這些變化在轉(zhuǎn)染JDP2組的BxPC3細(xì)胞中卻并不明顯。說(shuō)明轉(zhuǎn)染JDP2后的BxPC3細(xì)胞能夠抑制由Collagen I或TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMT。TGF-β與其受體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)Smad信號(hào)通路，通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)EMT發(fā)生［21，22］。在人的角質(zhì)細(xì)胞中，由 TGF-β 誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMT需要Ras基因的激活［23］。而在人胰腺癌中，Collagen I通過(guò)激活JNK1而使得胰腺癌的N-cadherin表達(dá)上調(diào)從而增加其侵襲能力［24］。這些都提示，JDP2抑制胰腺癌EMT的機(jī)制很可能通過(guò)抑制AP-1來(lái)阻斷Ras或JNK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，但是其確切機(jī)制目前研究仍是空白。

綜上所述，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染JDP2后的BxPC3胰腺癌細(xì)胞能夠抑制Collagen I或TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的EMT。由此可見(jiàn)，JDP2可通過(guò)不同的通路與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，作為一種抑癌因子，將為胰腺癌的分子靶向治療提供新的方向。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E Murrary T，et al.Cancer statistics，2006［J］.CA Cancer J Clin，2006，56（2）：106-130.

［2］Aronheim A，Zandi E，Hennemann H，et al.Isolation of an AP-1 repressor by a novel method for detecting protein-protein interactions［J］.Mol Cell Biol，1997，17（6）：3094-3102.

［3］Heinrich R，Livne E，Ben-Izhak O，et al.The c-Jun dimerization protein 2 inhibits cell transformation and acts as a tumor suppressor gene［J］.J Biol Chem，2004，279（7）：5708-5715.

［4］Cheng GZ，Chan J，Wang Q，et al.Twist transcriptionally up-regulates AKT2 in breast cancer cells leading to increased migration，invasion，andresistancetopaclitaxel［J］.CancerRes，2007，67（5）：1979-1987.

［5］Taki M，Kamata N，Yokoyama K，et al.Down-regulation of Wnt-4 and up-regulation of Wnt-5a expression by epithelial-mesenchymal transition in human squamous carcinoma cells［J］.Cancer Sci，2003，94（7）：593-597.

［6］Bertran E，Caja L，Navarro E，et al.Role of CXCR4/SDF-1 alpha in the migratory phenotype of hepatoma cells that have undergone epithelial-mesenchymal transition in response to the transforming growth factor-beta［J］.Cell Signal，2009，21（11）：1595-1606.

［7］Wang Z，Li Y，Ahmad A，et al.Pancreatic cancer：understanding and overcomingchemoresistance［J］.NatRewGastroenterolHepatol，2011，8（1）：27-33.

［8］Berger AJ，Kluger HM，Li N，et al.Subcellular localization of activating transcription factor 2 in melanoma specimens predicts patient survival［J］.Cancer Res，2003，63（23）：8103-8107.

［9］Cano CE，Motoo Y，Iovanna JL.Epithelial-to-mesenchymal transition inpancreaticadenocarcinoma［J］.ScieWorldJ，2010，10：1947-1957.

［10］Chaffer CL，Weinberg RA.A perspective on cancer cell metastasis［J］.Science，2011，331（6024）：1559-1564.

［11］王黎，李丹明.放化療治療中晚期胰腺癌療效的Meta分析［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，32（1）：129-135.

［12］Rhim AD，Mirek ET，Aiello NM，et al.EMT and Dissemination Precede Pancreatic Tumor Formation［J］.Cell，2012，148（1-2）：349-361.

［13］Jin C，Ugai H，Song J，et al.Identification of mouse Jun dimerization protein 2 as a novel repressor of ATF-2 ［J］.FEBS Lett，2001，489（1）：34-41.

［14］Pan J，Nakade K，Huang YC，et al.Suppression of cell-cycle progression by Jun dimerization protein-2 （JDP2）involves downregulation of cyclin-A2［J］.Oncogene，2010，29（47）：6245-6256.

［15］Hill KK，Roemer SC，Jones DN，et al.A progesterone receptor coactivator（JDP2）mediates activity through interaction with residues in the carboxyl-terminal extension of the DNA binding domain［J］.J Biol Chem，2009，284（36）：24415-24424.

［16］Weidenfeld-Baranboim K，Bitton-Worms K，Aronheim A.TRE-dependent transcription activation by JDP2-CHOP10 association［J］.Nucleic Acids Res，2008，36（11）：3608-3619.

［17］Rasmussen MH，Wang B，Wabl M，et al.Activation of alternative Jdp2 promoters and functional protein isoforms in T-cell lymphomas by retroviral insertion mutagenesis［J］.Nucleic Acids Res，2009，37（14）：4657-4671.

［18］Hwang HC，Martins CP，Bronkhorst Y，et al.Identification of oncogenes collaborating with p27Kip1 loss by insertional mutagenesis and high-throughput insertion site analysis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（17）：11293-11298.

［19］Stewart M，Mackay N，Hanlon L，et al.Insertional mutagenesis reveals progression genes and checkpoints in MYC/Runx2 lymphomas［J］.Cancer Res，2007，67（11）：5126-5133.

［20］Bitton-Worms K，Pikarsky E，Aronheim A.The AP-1 repressor protein，JDP2，potentiates hepatocellular carcinoma in mice［J］.Mol Cancer，2010，9：54.

［21］Thuault S，Valcourt U，Petersen M，et al.Transforming growth factor-beta employs HMGA2 to elicit epithelial-mesenchymal transition［J］.J Cell Biol，2006，174（2）：175-183.

［22］Thuault S，Tan EJ，Peinado H，et al.HMGA2 and Smads co-regulate SNAIL1 expression during induction of epithelial-to-mesenchymal transition［J］.J Biol Chem，2008，283（48）：33437-33446.

［23］Davies M，Robinson M，Smith E，et al.Induction of an epithelial to mesenchymal transition in human immortal and malignant keratinocytes by TGF-beta1 involves MAPK，Smad and AP-1 signalling pathways［J］.J Cell Biochem，2005，95（5）：918-931.

［24］Shintani Y，Hollingsworth MA，Wheelock MJ.CollagenⅠ promotes metastasis in pancreatic cancer by activating c-Jun NH2-Terminal Kinase 1 and up-regulating N-cadherin expression［J］.Cancer Res，2006，66（24）：11745-11753.