采用組織芯片技術(shù)進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的研究

劉 勇，袁 晟

(江西省人民醫(yī)院病理科，江西 南昌 330006)

標(biāo)準(zhǔn)化是組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和發(fā)展的方向之一[1]，也是病理科質(zhì)量控制的重要組成部分，而標(biāo)準(zhǔn)化的主要內(nèi)容是技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，蘇木精-伊紅(HE)染色方法是病理科最常用的染色方法，被稱為常規(guī)染色方法，所以，HE染色的標(biāo)準(zhǔn)化更是病理科質(zhì)控的重中之重。組織芯片(組織微陣列)一般是指將數(shù)十至上千個(gè)小組織整齊地排放在一張載玻片上而制成的組織切片[2]。我們采用組織芯片技術(shù)制作了人體不同正常組織和不同腫瘤組織的組織芯片，分組進(jìn)行了HE染色實(shí)驗(yàn)，旨在不同類型的組織中找到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的染色程序。

1 材料與方法

1.1 材料 從我院病理科2010年送檢新鮮標(biāo)本中收集不同病理組織60例制作組織芯片，其中淋巴組織、胃腸腺上皮、皮膚鱗狀上皮、皮下結(jié)締組織、骨骼肌組織、子宮平滑肌組織、肝臟組織、乳腺組織、肺組織、胰腺組織各3例；淋巴腫瘤組織、胃腸腫瘤組織、皮膚鱗狀上皮腫瘤組織、肺腫瘤組織、乳腺腫瘤組織、肝臟腫瘤組織、子宮平滑肌腫瘤組織、骨骼肌腫瘤組織，胰腺腫瘤組織、甲狀腺腫瘤組織各3例。所有標(biāo)本均按中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著的《臨床技術(shù)操作規(guī)范—病理學(xué)分冊(cè)》的要求進(jìn)行組織前處理。Mayer蘇木素染色液、伊紅Y染色液均購自貝索公司。

1.2 組織芯片制作 組織芯片制作：將熔化石蠟(加入等量的蜂蠟)制作4.0cm×2.0cm×1.0cm大小的空白蠟塊，設(shè)計(jì)10×6點(diǎn)組織列陣，用打孔機(jī)制成模塊。將原蠟塊放在45℃溫箱中烘5-10min，然后，用打孔針從組織塊選定部位逐個(gè)取出組織芯，組織芯直徑2mm，將組織芯放入預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模塊中，排布成組織芯片。最后，將制成的組織芯片面朝下放在銅板上，于55℃放置30min，輕壓模塊使組織芯在模塊中排平。對(duì)組織芯片蠟塊切片,切下的組織平整地粘貼于載玻片上。

1.3 方法 將HE染色中的幾個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行分組染色：①其中烤片溫度分成5組：A：65℃ 30h、B：70℃ 30min、C：75℃ 30min、D：80℃ 20min，E：85℃15min。②Mayer蘇木素染色分成3組：Ⅰ：2min、Ⅱ：4min、Ⅲ：6min。③伊紅Y染色分成3組：a組：2min、b組：3min、c組 4min。 進(jìn)行交叉分組染色。

2 結(jié)果

2.1 60例人體不同組織和腫瘤組織的組織芯片，每張組織芯片上60個(gè)樣品，排列整齊，外形為圓形或類圓形，較少的皺折和掉片現(xiàn)象(圖1)。

2.2 五個(gè)烤片組中，C、D、E三組切片的細(xì)胞、組織不夠清晰，染色色彩不鮮艷，A、B兩組細(xì)胞組織清晰，染色色彩鮮艷，但A組有少許組織掉片。

2.3 Mayer蘇木素染色的三個(gè)染色組：I組切片，染色稍淡，對(duì)于一些皮下結(jié)締組織、平滑肌組織的細(xì)胞核顯示不夠清楚，II組切片顯示各類組織中的細(xì)胞核清晰，核膜、染色質(zhì)清晰可見，胞漿紅色鮮艷，未見蘇木素染色；III組切片染色過深，某些淋巴組織、大部分腫瘤組織的細(xì)胞核核膜、染色質(zhì)顯示不清晰。

圖1 組織芯片排列整齊，外形為圓形或類圓形(HE染色×100)

2.4 伊紅Y染色組：a組切片：伊紅染色稍淡，顏色不夠鮮艷。一些纖維結(jié)締組織染色過淺；b組切片：伊紅染色深淺適中，顏色清晰艷麗，顏色層次分明，與藍(lán)色的細(xì)胞核對(duì)比突出。c組切片：染色稍深，顏色層次不分明，部分細(xì)胞核有伊紅著色至細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，與細(xì)胞核對(duì)比不突出。

2.5 本實(shí)驗(yàn)顯示，用70℃烤片30min，蘇木素染色4min，伊紅染色3min的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行HE染色效果最佳，組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核蘇木素染色呈藍(lán)色，核膜、染色質(zhì)清晰可辨，胞漿伊紅染色層次分明，顏色鮮艷(圖 2)。

圖2 細(xì)胞核清晰，核膜、染色質(zhì)清晰可見，胞漿層次分明，顏色鮮艷(HE染色×400)

3 討論

組織芯片技術(shù)原理：組織芯片是通過組織芯片制作機(jī)細(xì)針打孔的方法，從眾多的組織蠟塊(供體蠟塊)中采集到數(shù)十至上千的圓柱形小組織(組織芯)，并將其整齊排放到另一個(gè)空白蠟塊(受體蠟塊)中而制成組織芯片蠟塊。然后，對(duì)組織芯片蠟塊進(jìn)行切片，再將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上制成組織芯片。組織芯片的特點(diǎn)是：體積小，信息含量大，一次性實(shí)驗(yàn)即可獲大量結(jié)果。組織芯片可做HE染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色、DNA和RNA原位分子雜交、熒光原位雜交。組織芯片蠟塊可做100～200張連續(xù)切片。這樣用同一套組織芯片即可迅速地對(duì)上百種生物分子標(biāo)記 (如抗原、DNA和RNA)進(jìn)行分析、檢測，因而倍受組織病理學(xué)家的重視[3]。1998年Kononen等[4]首次采用組織芯片技術(shù)將645例乳腺癌組織固定于載體上，同時(shí)進(jìn)行多種基因的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)erbB-2和myc表達(dá)在雌激素受體(ER)陰性者明顯高于ER陽性者，p53陽性者明顯高于p53陰性者，而CCND1基因則與p53、ER、erbB-2表達(dá)無明顯關(guān)系。從此，眾多學(xué)者開始對(duì)組織芯片技術(shù)進(jìn)行研究，組織芯片技術(shù)不斷發(fā)展和完善，其應(yīng)用也愈來愈廣泛[5，6]。

我們制作了60例人體不同組織和腫瘤組織的組織芯片，僅用幾張芯片即完成了全部實(shí)驗(yàn)，極大節(jié)約了研究經(jīng)費(fèi)和降低了勞動(dòng)量，因此，應(yīng)用組織芯片大規(guī)模高效檢測臨床組織樣本是可行的，組織芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的病理學(xué)技術(shù)方法相比，具有快速、方便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，其應(yīng)用前景廣闊。

HE染色方法的建立已有一百多年歷史，其技術(shù)雖已很成熟，但由于不同組織內(nèi)所含的成分不同，導(dǎo)致組織與玻片的粘附力不同；蘇木素和伊紅對(duì)不同組織的染色力也有一定的不同，所以不同的組織所需要的烤片時(shí)間、染色時(shí)間理論上也是不同的，并且，因?yàn)镠E染色是一種多步驟、多因素決定的實(shí)驗(yàn)方法，無論是手工還是機(jī)器操作，都存在著許多影響因素，甚至?xí)霈F(xiàn)不理想的染色結(jié)果,從而導(dǎo)致誤判和誤診[7]。在日常工作中，我們不可能對(duì)每一組織單獨(dú)染色，只能找出一個(gè)相對(duì)適合的染色程序，本實(shí)驗(yàn)顯示，用70℃烤片30min，蘇木素染色4min，伊紅染色3min比較合適于大部分組織的染色，可作為病理實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行批量染色。此外，現(xiàn)在國內(nèi)病理科用得比較多的Harrys蘇木素是退行性染色，需要用0.5%鹽酸酒精分化，而分化是比較難控制的一個(gè)步驟，不利于進(jìn)行質(zhì)量控制，我們推薦使用Mayer蘇木素進(jìn)行核的染色，因?yàn)镸ayer蘇木素是進(jìn)行性染色，不需要分化，有利于設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)化染色程序而進(jìn)行質(zhì)量控制。

[1]馬恒輝,周曉軍,陳國璋.淺淡組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化[J].診斷病理學(xué)雜志,2002,6:374.

[2]劉 勇,戴艷枝,袁 晟.采用組織芯片技術(shù)檢測乳腺癌中泛素、S期激酶相關(guān)蛋白2、細(xì)胞周期調(diào)控因子p27的表達(dá)[J].中華外科雜志,2004,5:309-310.