抗球蟲新化合物納川珠利的一般毒理學研究

費陳忠，林 洋，張 濤，薛飛群，張可煜，張麗芳，王霄旸，孟新宇，王 米，鄭文麗，李 濤

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室，農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲病學重點開放實驗室，上海 200241;2.鄭州市獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450003;3.濟源市畜牧局，河南濟源 454650)

雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴重的寄生蟲病，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，藥物防治是雞球蟲病的重要防治手段之一［1］，但由于新藥研制的復雜性和成本因素的影響，自20世紀80年代末至今，未見真正的新型高效抗球蟲藥物面世，長期使用老藥帶來的耐藥性問題越來越嚴重，因此迫切需要研究新型抗球蟲藥物。

三嗪類抗球蟲藥物是目前已知用藥濃度最低的抗球蟲藥物，代表藥物為地克珠利(Diclazuril)和妥曲珠利(Toltrazuril)［2］，具有高效、廉價和使用廣泛的特點。本研究室在對此類藥物深入研究的基礎上，發(fā)現(xiàn)新化合物納川珠利(Nitromezuril)具有高效的抗雞球蟲活性［3-6］，并且對人工誘導地克珠利耐藥株敏感，無交叉耐藥現(xiàn)象，為進一步了解該化合物使用過程中的安全性，提供臨床合理用藥依據(jù)，本試驗對納川珠利的小鼠經(jīng)口急性毒性和蓄積毒性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品 納川珠利原料藥，含量99.81%，中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所自制。藥物溶媒：0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.2 實驗動物 清潔級昆明小鼠，雌雄各半，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物合格證編號：2007000502292、2007000501984，試驗鼠購入后置專用小鼠隔離器飼養(yǎng)，正式試驗前適應性飼養(yǎng)4 d以上。

1.3 急性毒性試驗 通過反復預試驗確定LD0～LD100區(qū)間范圍，并依之分組，確定組間比。正式試驗選用18～22 g的小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，雌雄各半，各組用藥量分別為350、455、592、769、1000、1300、1689 mg/kg 體重，對小鼠經(jīng)口 1 次灌服，給藥后連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計死亡率，分別以改良寇氏法和機率單位加權回歸法(Bliss法)計算LD50值及其95%可信限范圍;用藥后觀察小鼠臨床癥狀，并將死亡小鼠剖檢，觀察其內(nèi)臟等實質(zhì)器官的病理變化。

1.4 蓄積毒性試驗 選擇體重在15～18 g的小鼠60只，給藥組40只，0.5%羧甲基纖維素鈉對照組20只，雌雄各半，每天一次灌胃給藥，起始劑量為0.1個 LD50，采用劑量遞增連續(xù)染毒法來評價藥物的蓄積毒性，給藥方案見表1，試驗期間觀察小鼠的一般表現(xiàn)并按時稱重，當實驗動物累積死亡達50%時停止給藥，記錄小鼠死亡數(shù)并計算體重。

1.5 耐受性試驗 蓄積毒性試驗停止給藥后，從試驗組和對照組中分別隨機抽取小鼠10只，雌雄各半，每只1次經(jīng)口灌服1個 LD50劑量的供試物，觀察并記錄動物死亡數(shù)，比較試驗組和對照組小鼠的死亡率差異，評價小鼠對試驗化合物的耐受性。

表1 納川珠利蓄積毒性的給藥方案

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗結果用 SPSS for windows 15.0軟件包進行統(tǒng)計。耐受性試驗中的死亡率差異用Fisher精確概率法的卡方檢驗，小鼠體重的變化采用單因素方差分析，進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 急性毒性試驗 中、高劑量組小鼠給藥后臨床可見行動遲緩、步態(tài)不穩(wěn)、精神萎靡。高劑量組小鼠部分見有眼睛紅腫，給藥8 h后，陸續(xù)出現(xiàn)動物死亡，死亡時間多集中在給藥后8～33 h;48 h后，小鼠精神、食欲等各項體征明顯好轉;96 h后基本恢復正常。死亡小鼠剖檢顯示，內(nèi)臟未見明顯肉眼可見的病變，各組死亡情況見表2。采用寇氏改良法計算的 LD50為 768 mg/kg，95%可信限為644～916 mg/kg;采用機率單位加權回歸法(Bliss法)計算的LD50為769 mg/kg，95%可信限為615～960 mg/kg。

表2 小鼠灌胃給藥急性毒試驗結果

2.2 蓄積毒性試驗 試驗過程中對照組小鼠無異常、無死亡。給藥組連續(xù)給藥5 d后，陸續(xù)出現(xiàn)被毛豎立、蓬松、無光澤以及行動遲緩等臨床癥狀，11 d后出現(xiàn)死亡，至19 d共死亡21只，死亡小鼠剖檢見有肝臟色深變暗，肉眼未見其他異常，給藥組累積給藥劑量為4.26 LD50，蓄積系數(shù)為4.26。給藥組小鼠體重與對照組小鼠體重的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明試驗藥物對小鼠增重有明顯影響，結果見表3。

表3 納川珠利蓄積毒性試驗小鼠體重變化(X±SE，g)

2.3 耐受性試驗 蓄積毒性試驗結束后，于給藥組和對照組小鼠中隨機選取10只小鼠分別給予1個LD50劑量的藥物，結果給藥組死亡4只，對照組死亡2只，死亡率分別為40%、20%，由于總體樣本較小，采用了Fisher精確概率法的卡方檢驗，兩組死亡率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

LD50測試是毒理學急性毒性評價的經(jīng)典方法之一，可以反映毒性反應程度與劑量的關系。雖然現(xiàn)有相當多的毒理學家相繼提出了代替LD50的急性毒性評價方法，并得到官方支持和采納，取得了相當?shù)倪M展，但其依然是我國新獸藥申報的必備試驗之一［7］。納川珠利作為本研究室研制的新型三嗪類抗球蟲化合物，檢索結果為全新化學結構，毒理學試驗結果是其成藥性的關鍵。

本試驗采用了寇氏改良法計算的LD50為768 mg/kg，95%可信限為644～916 mg/kg;采用機率單位加權回歸法(Bliss法)計算的LD50為769 mg/kg，95%可信限為615～960 mg/kg。改良寇氏法是顧漢頤提出的［8］，在國內(nèi)被普遍使用，而機率單位加權回歸法是Bliss等提出的，在國外被普遍使用，兩種不同計算方法得到的 LD50分別為 768、769 mg/kg，結果基本一致。按照相關動物等效劑量［9］換算成大鼠急性毒性LD50約為420 mg/kg，同類藥物地克珠利小鼠口服 LD50＞ 10000 mg/kg［10］，妥曲珠利的小鼠口服 LD50為 5011 mg/kg［11］，都明顯低于該新化合物，說明納川珠利的相對毒性較大，根據(jù)外源化學物急性毒性分級標準［11］(WHO)，屬于中毒類，但其LD50值仍然在靶動物雞體推薦使用劑量的百倍以上，由此推斷，納川珠利對靶動物雞的毒性很低，相對安全范圍較寬，使用安全。

蓄積毒性是評價藥物是否容易引起慢性中毒的指標，一般生物半衰期長的化合物蓄積毒性較大，我國的飼料添加劑要求蓄積系數(shù)不大于3［12］。本試驗中試驗組小鼠的體重明顯小于對照組(P＜0.01)，死亡小鼠解剖可見肝臟顏色變暗，說明肝臟可能是藥物的毒性靶器官。供試化合物計算得到的蓄積系數(shù)為4.26，與同類藥物妥曲珠利報道的小鼠的蓄積系數(shù)4.26一致［11］，根據(jù)化學蓄積作用分級［14］屬于中等蓄積范圍，說明其在動物體內(nèi)代謝和清除較快，可作為抗球蟲飼料添加劑使用。

耐受性試驗中，對照組和試驗組的死亡率分別為20%和40%，由于總體樣本較小，按統(tǒng)計學要求選用了Fisher精確概率法的卡方檢驗，結果對照組和試驗組的死亡率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示長期給藥后小鼠沒有增加對化合物的耐受性或適應性。

綜上所述，可初步認為該新化合物的毒性較低，在臨床上應用相對安全，具有較好的成藥性和開發(fā)前景。

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