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    甲砜霉素及氟苯尼考胺單克隆抗體的制備及特性鑒定

    2012-11-29 08:08:08金銀珍劉智宏王鶴佳黃耀凌張聰敏
    中國獸藥雜志 2012年10期
    關(guān)鍵詞:雜交瘤氯霉素單克隆

    金銀珍,劉智宏,王鶴佳,黃耀凌,張聰敏

    (中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

    酰胺醇類抗生素除其代表藥物——氯霉素外,還有甲砜霉素和氟苯尼考(氟甲砜霉素)。但是由于氯霉素存在嚴(yán)重的副作用,國際上相繼禁止或嚴(yán)格限制使用氯霉素,目前出現(xiàn)了用甲砜霉素和氟苯尼考替代氯霉素使用的趨勢(shì)[1-2]。甲砜霉素和氟苯尼考屬廣譜抑菌藥物,具有較高的抗菌活性,主要用于治療畜、禽腸道、呼吸道等細(xì)菌性感染[3],尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。但是甲砜霉素仍有免疫抑制作用,其使用有引起耐藥性細(xì)菌存在的風(fēng)險(xiǎn),除我國和日本外,歐盟和美國均將甲砜霉素禁用于食品動(dòng)物。我國規(guī)定甲砜霉素在各種動(dòng)物組織中的最高殘留限量(MRL)為50 μg/kg,氟苯尼考?xì)埩魳?biāo)示物為氟苯尼考胺,其在不同動(dòng)物肌肉組織中的 MRL 為 100 ~300 μg/kg[4]。

    已報(bào)道的動(dòng)物組織中甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩魴z測(cè)方法有氣相色譜法[5-6]、氣相色譜 - 質(zhì)譜法[7]、高效液相法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]及甲砜霉素和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法[9-11]。本研究以本試驗(yàn)室建立的甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法為基礎(chǔ),應(yīng)用能穩(wěn)定分泌抗甲砜霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,可為甲砜霉素及氟苯尼考胺檢測(cè)試劑盒提供長期穩(wěn)定的單克隆抗體。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要儀器和試劑 酶標(biāo)讀數(shù)儀,SUNRISE,TECAN公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),Biofuge stratos,Heraeus公司;漩渦振蕩器,MS2,IKA公司;電子天平,Sartorious公司;倒置顯微鏡,Olympus公司;甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備;氟苯尼考胺,TRC公司;聚乙二醇(PEG)4000、氟苯尼考、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Giemsa染料、秋水仙素、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG及羊抗鼠IgG亞類抗體,Sigma公司;DMEM干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT及HT,Gibco公司;其他所有化學(xué)試劑均為分析純;檢測(cè)抗原為本實(shí)驗(yàn)室自制。

    1.1.2 溶液 洗液:0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液,0.05%Tween -20,pH 7.2。封閉液:5% 脫脂奶洗液。包被緩沖液:0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液,pH 9.5。標(biāo)準(zhǔn)溶液:0、0.2、1、5、25、125 μg/L 甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。底物溶液:0.01%TMB,以0.1 mol/L磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH 5.0)配制。

    1.1.3 動(dòng)物及細(xì)胞系 Balb/c小鼠,北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 酰胺醇類藥物免疫抗原制備和免疫 免疫抗原的制備及鑒定按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。以免疫抗原免疫6~8周齡雌性Balb/c小鼠20只,首次免疫用2 mg/mL免疫抗原(以載體蛋白計(jì))1 mL,加等量弗氏完全佐劑乳化,免疫劑量為100 μg/只,于小鼠頸部、背部皮下多點(diǎn)注射。以后與首次免疫相同的劑量加弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫3次,每次間隔2周。于末次免疫后7 d采血,用間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)。選擇抗血清效價(jià)高及競爭抑制強(qiáng)的小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合,融合前3 d腹腔注射加強(qiáng)免疫。

    1.2.2 間接競爭ELISA方法的建立 將檢測(cè)抗原用碳酸鹽緩沖液稀釋,包被酶聯(lián)板,每孔150 mL,4℃放置過夜。傾去孔內(nèi)液體,拍干,加入洗液250 mL,洗板3次。加入封閉液每孔250 mL,室溫放置2 h,洗液洗板3次。酶標(biāo)板單數(shù)列加入0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL,雙數(shù)列加入100 ng/mL濃度甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL,取1000倍稀釋的小鼠血清(或細(xì)胞上清液)50 mL分別加到兩濃度的酶標(biāo)板中,室溫孵育1 h。洗液洗板3次,每孔加入羊抗鼠IgG溶液100 mL,室溫孵育30 min。洗液洗板3次。加入底物溶液100 mL,避光顯色10~30 min。加入終止液100 mL,在450 nm波長處測(cè)定吸光度值。

    1.2.3 細(xì)胞融合、克隆及腹水制備[12]免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0以5~10∶1的比例混合,用50%PEG作融合劑將兩種細(xì)胞融合,將融合細(xì)胞懸于含20%胎牛血清的2%HAT選擇性培養(yǎng)基內(nèi),加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃下于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在融合后第7~12天,細(xì)胞生長達(dá)1/3~1/4視野時(shí),取融合細(xì)胞的上清液進(jìn)行篩選。以篩選到與0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液有反應(yīng),與100 ng/mL濃度甲砜霉素有明顯抑制的細(xì)胞孔進(jìn)行亞克隆。一般亞克隆后第7~10天再次進(jìn)行單克隆孔的ELISA篩選,如此亞克隆3~5次,至陽性率達(dá)100%為止。然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并將細(xì)胞于液氮下保存。

    選取20~22 g雌性Balb/c小鼠20只,腹腔注射0.5 mL液體石蠟7 d后,腹腔注射雜交瘤2×106細(xì)胞,7~14 d后待小鼠腹部顯著膨隆,抽取小鼠腹水,5000 r/min離心5 min,吸出上清液備用。

    1.2.4 單克隆抗體類型的鑒定 用1%瓊脂糖磷酸鹽緩沖液制備平板,取小鼠腹水10 mL加到中心孔,加羊抗鼠IgG各亞類抗體10 mL到周邊孔中進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),37℃濕盒孵育過夜。

    1.2.5 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[12]。

    1.2.6 抗體效價(jià)及靈敏度測(cè)定 用洗液系列稀釋雜交瘤細(xì)胞上清液及小鼠腹水,按1.2.2項(xiàng)方法操作,取0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值為1.5~1.8的抗體稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。選擇系列稀釋的甲砜霉素藥物濃度,選擇最佳抗體濃度,按基本間接競爭ELISA進(jìn)行測(cè)定。以甲砜霉素濃度的對(duì)數(shù)值為X軸,以各濃度的OD值除以0濃度的OD值(B/B0)為Y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定IC50濃度范圍。

    1.2.7 交叉反應(yīng)率 選擇酰胺醇類藥物氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺,分別配成系列濃度,按1.2.2項(xiàng)方法測(cè)定,確定IC50濃度。用下式計(jì)算各藥物對(duì)該抗體的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率=甲砜霉素IC50/待測(cè)藥物IC50×100%。

    2 結(jié)果

    2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 免疫5次后,采集免疫小鼠血清,用間接競爭ELISA測(cè)定小鼠抗血清對(duì)藥物的抑制程度,選擇抑制最明顯的2-1號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合,2塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板全部有雜交瘤細(xì)胞形成,融合率為100%。用間接競爭ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液,其中有抑制的為26孔,選其中OD值較高的2個(gè)孔進(jìn)行亞克隆,通過3次克隆化后獲得IC50較低的雜交瘤細(xì)胞株1E及5C,通過傳代、凍存及復(fù)蘇,其雜交瘤細(xì)胞生長良好并能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。

    2.2 單克隆抗體特性鑒定結(jié)果

    2.2.1 雜交瘤核型鑒定結(jié)果 本試驗(yàn)獲得的雜交瘤1E染色體數(shù)目為96~102條,平均98條。

    2.2.2 抗體類型鑒定 本試驗(yàn)所制的單克隆抗體雜交瘤1E及5C所分泌的抗體類型為IgG2b。

    2.3 靈敏度及效價(jià)測(cè)定 雜交瘤1E第一代細(xì)胞上清抗體效價(jià)為1∶5×103;將細(xì)胞凍存及復(fù)蘇傳代,第二代細(xì)胞上清效價(jià)為1∶5×103,腹水抗體效價(jià)為1∶1×106。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為 0.2、1、5、25、125 μg/L,相應(yīng)的對(duì)數(shù)值分別為 -0.7、0、0.7、1.4 及 2.1。IC50變動(dòng)范圍為15~25 μg/L。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

    圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.4 雜交瘤1E分泌的抗體交叉反應(yīng)率 測(cè)定4種藥物的IC50,得出系列交叉反應(yīng)率,結(jié)果見表1。

    表1 交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    目前甲砜霉素和氟苯尼考胺殘留檢測(cè)主要以儀器方法為主,樣品一般經(jīng)過有機(jī)溶劑提取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、除脂肪,再經(jīng)固相萃取柱凈化等步驟進(jìn)行處理,樣品處理方法比較復(fù)雜,不適合大量樣品檢測(cè)的需要。近幾年來,免疫檢測(cè)技術(shù)在抗生素、農(nóng)藥、毒素等小分子化合物殘留分析中的應(yīng)用越來越廣泛,而抗體的制備則是建立免疫檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵。甲砜霉素、氟苯尼考與氯霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)的區(qū)別是在基本結(jié)構(gòu)中用甲磺基取代了毒性較強(qiáng)的硝基。為了獲得能抗甲砜霉素及氟苯尼考胺,但不與氯霉素有交叉的抗體,本試驗(yàn)用碳二亞胺法將氟苯尼考胺與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫抗原[11],將苯環(huán)上的甲磺基暴露在外作為主要的抗原決定簇,通過小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選、克隆和腹水制備,獲得了抗甲砜霉素、氟苯尼考胺的特異性的單克隆抗體。盡管單克隆抗體的研究技術(shù)比較成熟,但小分子藥物的單克隆與大分子物質(zhì)的抗體制備有明顯區(qū)別,主要因?yàn)榭乖拿庖咴暂^弱,且篩選方法不僅要考慮到抗體效價(jià),而且要考慮抑制率高低等因素。合理的篩選程序?qū)δ芊瘾@得高親和力的單抗細(xì)胞株非常重要,本實(shí)驗(yàn)選用自制的檢測(cè)抗原,用0濃度及高濃度甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行篩選,獲得了抗甲砜霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。盡管該抗體靈敏度不如本實(shí)驗(yàn)室同期制備的多克隆抗體,但該單克隆抗體效價(jià)高,特異性及靈敏度基本能滿足實(shí)際檢測(cè)要求,可以為今后檢測(cè)試劑盒的研發(fā)及生產(chǎn)提供長期穩(wěn)定的抗體。

    [1] 李秀波,石 波,梁 萍.新型廣譜抗菌藥一氟苯尼考[J].國外畜牧科技,1999,26(3):50 -52.

    [2] 張建民,鐘超平.獸用廣譜抗生素氟苯尼考的合成[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊(cè),1999,20(2):68 -71.

    [3] 中華人民共和國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○○五年版一部[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006:14-16.

    [4] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào).動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

    [5] 農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-13-2007.《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定——?dú)庀嗌V法》[S].

    [6] Alien P,Pfenning Jose E,Roybal Heidi S Rupp,et al.Simultaneous Determination of Residues of Chloramphenicol,F(xiàn)lorfenicol,F(xiàn)lorfenicol Amine,and Thiamphenicol in Shrimp tissue by Chromatography with Electron Capture Detection[J].Journal of AOAC International,2000,83(1):26 -30.

    [7] 農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-14-2007.《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定——?dú)庀嗌V-質(zhì)譜法》[S].

    [8] GB/T 207056-2006.《可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定——LC-MS-MS》[S].

    [9] 郝 凱,過世東,胥傳來,等.水產(chǎn)品中甲砜霉素殘留的CELISA檢測(cè)方法研究[J].食品工業(yè)科技,2006,2:186 -188.

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    [11]劉智宏,黃耀凌,汪 霞,等.水產(chǎn)品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫多殘留測(cè)定[J].中國獸藥雜志,2010,44(12):1 -5.

    [12] Heddy Zola.單克隆抗體手冊(cè)[M].周宗安.譯.南京:南京大學(xué)出版社,1991.

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