218例涂陽肺結核吡嗪酰胺耐藥情況分析＊

梁慶福，鄭金鳳，2，陳求揚，林淑芳，魏淑貞，趙 永，林 建

2.福建省醫(yī)科大學公衛(wèi)學院教學基地，福州 350004

吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）是重要的抗結核一線藥物，由于它在酸性（pH 5.5）環(huán)境中能殺滅半休眠期結核分枝桿菌，而其他藥物所無法做到，因此可縮短結核病化療期，在現(xiàn)代結核病控制中起著不可或缺的作用。但是實驗條件要求嚴格，因而各國常規(guī)抗結核藥物敏感試驗中均將吡嗪酰胺項空缺［1］。為初步了解肺結核患者對吡嗪酰胺的耐藥情況，為臨床結核病防治提供參考，我們采用WHO推薦的BACTEC MGIT－960系統(tǒng)法［2］對218例涂陽肺結核進行吡嗪酰胺耐藥性檢測，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 標本來自2008－2011年間全省結核病耐藥性監(jiān)測納入的分離菌株，隨機選取218株，具有常規(guī)藥敏結果等相關資料信息，菌型鑒定均為結核分枝桿菌。218例病例中初治163例，復治55例；男性164例，女性54例；耐多藥（multi－drug－resistant，MDR）91例，非MDR127例。年齡16～81歲。

1.2 儀器和試劑 美國BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT－960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)、鑒定、藥敏分析系統(tǒng)（BACTEC MGIT－960）及其配套試劑，包括MGIT培養(yǎng)管、MGIT OADC營養(yǎng)添加劑、PANTA雜菌抑制劑、吡嗪酰胺試劑等。

1.3 培養(yǎng)方法和藥物敏感試驗 MGIT培養(yǎng)管在無菌條件下加入0.8mL MGITPANTA/OADC混合液備用。取保存的菌液接種于已準備好的MGIT培養(yǎng)管中，將該管置入BACTEC MGIT－960中，儀器自動檢測，判斷培養(yǎng)管內(nèi)分枝桿菌的生長情況，若出現(xiàn)陽性結果，儀器自動提示。取出陽性培養(yǎng)管后，進行直接涂片抗酸染色，確認是否為分枝桿菌。取0.5mL經(jīng)確認為分枝桿菌的BACTEC MGIT－960陽性培養(yǎng)物接種于含標準濃度藥物的PZA藥敏專用MGIT培養(yǎng)管中（含PZA添加劑），培養(yǎng)物1∶10稀釋接種于PZA藥敏專用MGIT培養(yǎng)管（含PZA添加劑）中作為生長對照，然后置于BACTEC MGIT－960中，儀器根據(jù)分枝桿菌生長情況對比自動報告藥物敏感性結果。BACTEC MGIT－960系統(tǒng)測量嚴格按照生產(chǎn)廠家的操作說明進行。藥物濃度為：吡嗪酰胺（PZA，Z）100μg/mL。

1.4 質(zhì)量控制 每批試驗用H37Rv做對照，同時對耐吡嗪酰胺菌株進行再次復核以確保結果準確性。H37Rv由中國CDC結核病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用χ2檢驗，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 有關定義［3］初治涂陽肺結核：既往未用過或試用過抗結核藥物治療；應用抗結核藥物治療（不論什么疾?。┎蛔?個月的涂陽肺結核患者。復治涂陽肺結核：使用抗結核藥物治療≥1個月的涂陽肺結核患者。耐多藥（multi－drug－resistant，MDR）：指結核分枝桿菌至少對異煙肼、利福平2種及以上抗結核藥物耐藥。

1.7 生物安全 所有實驗操作均在BSL－2及以上實驗室中進行。

2 結 果

218例涂陽肺結核中耐吡嗪酰胺39例，占17.9%。其中164例男性患者耐吡嗪酰胺27例，占16.5%，54例復治患者耐吡嗪酰胺12例，占22.2%；163例初治患者耐吡嗪酰胺23例，占14.1%，55例復治患者耐吡嗪酰胺16例，占29.1%；91例MDR患者耐吡嗪酰胺36例，占39.6%，127例非MDR患者耐吡嗪酰胺3例，占2.4%。男女患者吡嗪酰胺耐藥率的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而復治患者吡嗪酰胺耐藥率明顯高于初治患者（P＜0.05），MDR患者吡嗪酰胺耐藥率明顯高于非MDR患者（P＜0.01），見表1。

表1 218例涂陽肺結核患者中的39例對吡嗪酰胺耐藥分析Tab.1 Analysis on PZA resistance in 39cases of 218smear positive pulmonary tuberculosis patients

3 討 論

自上世紀50年代以來，吡嗪酰胺就是用于結核病治療的一線藥物。最新研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺進入患者體內(nèi)后，通常會轉(zhuǎn)化為具有活性的吡嗪酸。吡嗪酸可以綁定對結核桿菌至關重要的核糖體蛋白S1，阻止這種蛋白編碼結核桿菌的脫氧核糖核酸，進而阻止結核桿菌產(chǎn)生維系其生存的其他蛋白［4］。正是通過這種方式，吡嗪酰胺可以將通常持續(xù)9至12個月的結核病療程縮短數(shù)個月，在現(xiàn)代結核病控制中起著重要的作用。由于PZA在結核病化療中的不可替代性，PZA藥敏試驗顯得尤為重要，但由于PZA僅在低pH（約pH5.5）環(huán)境中有活性，而如此低的pH又限制了許多結核桿菌臨床株的生長，因此難以在傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法基礎上建立可靠的PZA藥敏試驗，因此各國常規(guī)抗結核藥敏無法開展此項檢測，這給臨床治療造成困難。

為了更好指導臨床對吡嗪酰胺的使用，國內(nèi)外學者進行了一定技術研究，如國內(nèi)敖軍平等研究的吡嗪酰胺耐藥性噬菌體檢測技術［5］，王冬敏等的顆粒顯色指示技術［6］等，均獲得較好的實驗結果，但未得到推廣使用。BACTEC MGIT－960系統(tǒng)法是具有美國FDA認證的一線抗結核藥物藥敏試驗方法，被WHO推薦使用［2］，在發(fā)達國家通常作為標準方法，但其吡嗪酰胺耐藥性測定需要專用的培養(yǎng)基和配套試劑，費用昂貴，限制了它的推廣應用。

本研究采用WHO推薦的BACTEC MGIT－960系統(tǒng)法［2］進行吡嗪酰胺藥物敏感性檢測，共檢測涂陽肺結核患者218例，耐吡嗪酰胺39例，占17.9%，耐藥主要發(fā)現(xiàn)于MDR肺結核中，MDR肺結核吡嗪酰胺耐藥率達39.6%（36/91），接近孫冰梅等［7］報道的BACTEC 460法檢測MDR肺結核吡嗪酰胺耐藥率54.7%，且明顯高于非 MDR患者的2.4%（3/127）（P＜0.01），提示MDR肺結核更易發(fā)生吡嗪酰胺耐藥。研究同時發(fā)現(xiàn)復治患者的吡嗪酰胺耐藥率（29.1%）也明顯高于初治患者（14.1%）（P＜0.05），這可能與復治患者中 MDR患者比例高（78.2%，43/55）有關。由于吡嗪酰胺是重要的抗結核一線藥物，是目前復治涂陽肺結核和MDR肺結核標準治療方案中的主要藥物［3，8］，鑒于本研究發(fā)現(xiàn)在復治涂陽肺結核，尤其是MDR肺結核中對本藥的耐藥率較高，筆者認為臨床應重視對MDR肺結核患者吡嗪酰胺藥物敏感性的監(jiān)測，以選用合適的治療方案，確保MDR肺結核得到更合理有效的治療。同時建議有條件的地方應把吡嗪酰胺藥敏納入復治涂陽肺結核的常規(guī)檢測，甚至可直接作為臨床常規(guī)抗結核藥敏檢測項目，以更好指導臨床用藥。

本研究結果顯示肺結核吡嗪酰胺耐藥率較高，這與本檢測對象中 MDR肺結核比例高（41.7%，91/218）有關，其MDR肺結核的高耐吡嗪酰胺率提示將給現(xiàn)行的MDR肺結核標準治療方案提出挑戰(zhàn)，值得深入探討。

（感謝福建省立醫(yī)院胡辛蘭老師對本課題工作的大力幫助）

［1］Jiang Y，Peng JP，Yang F，et al.Molecular basis ofMycobacterium tuberculosisto pyrazinamide resistance［J］.Progr Microbiol Immunol，2007，35（1）：5－9.（in Chinese）姜英，彭俊平，楊帆，等.結核分枝桿菌耐吡嗪酰胺分子機制研究［J］.微生物學免疫學進展，2007，35（1）：5－9.

［2］World Health Organaization.Policy guidance on drug－susceptibility testing （DST）of second－line antituberculosis drug ［S］.Geneva：WHO，2008：11.

［3］Department of Disease Control，MOH，Department of Medical Administration，MOH，Chinese Center for Disease Control and Prevention.Guidelines for implementing the bational tuberculosis control program in China（2008）［S］.Beijing：Peking Union Medical College Press，2009：52－71.（in Chinese）衛(wèi)生部疾病預防控制局，衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國疾病預防控制中心.中國結核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008年版）［S］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2009：52－71.

［4］Shi WL，Zhang XL，Jiang X，et al.Pyrazinamide inhibits translation inMycobacteriumtuberculosis.［J］.Science，2011，333（6049）：1630－1632.DOI：10.1126/science.1208813

［5］Ao JP，Chen JW，Hu ZY，et al.A study of the bacteriophage－based assay for the detection of pyrazinamide resistance inMycobacterium tuberculosis［J］.Chin J Tuberc Respir Dis，2006，29（9）：625－628.（in Chinese）敖軍平，陳秀武，胡忠義，等.吡嗪酰胺耐藥性結核分枝桿菌的噬菌體檢測技術研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2006，29（9）：625－628.

［6］Wang DM，Lin JX，Peng DD，et al.The value of particle colorimetric technique in rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisresistance to pyrazinamide［J］.Chin J Antituberc，2011，33（9）：596－599.（in Chinese）王冬敏，林健雄，彭東東，等.顆粒顯色指示技術快速檢測結核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥性的價值［J］.中國防癆雜志，2011，33（9）：596－599.

［7］Sun BM，Zhu J，Gao J.Detection of pyrazinamide－resistant gene pncA of multi－drug－resistantMycobacteriumtuberculosisisolates［J］.Shanxi Med J，2007，36（7）：665－666.（in Chinese）孫冰梅，朱婕，高靜.耐多藥結核分支桿菌臨床分離株吡嗪酰胺耐藥基因pncA的檢測［J］.山西醫(yī)藥雜志，2007，36（7）：665－666.

［8］Wang Y.Programme of work for multi－drug resistant pulmonary tuberculosis control and management［S］.Beijing：Military Medical Science Press，2012：16－33.（in Chinese）王宇.耐多藥肺結核防治管理工作方案［S］.北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2012：16－33.