樹突狀細(xì)胞DNA多價(jià)疫苗抗日本血吸蟲感染作用機(jī)制的研究＊

血吸蟲病是一種流行廣泛、嚴(yán)重危害人體健康并影響畜牧業(yè)生產(chǎn)的人獸共患寄生蟲病。作為吡喹酮化療的補(bǔ)充，血吸蟲病疫苗的研究是一種更有效的控制措施。血吸蟲病疫苗的研究已有半個(gè)多世紀(jì)，歷經(jīng)死疫苗、減弱活疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗四個(gè)階段。盡管血吸蟲病疫苗的研究工作已取得一定的進(jìn)展，但離實(shí)際應(yīng)用尚有一定的距離，增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果便成為當(dāng)前血吸蟲病疫苗研究的焦點(diǎn)，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)血吸蟲的生物學(xué)特性、血吸蟲與宿主的相互關(guān)系以及混合抗原、細(xì)胞免疫、疫苗免疫方法、免疫途徑、佐劑應(yīng)用等基礎(chǔ)方面的研究［1］。

樹突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)功能最強(qiáng)的一種專職抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起著核心作用。由于其獨(dú)特的功能，DC目前廣泛應(yīng)用于抗感染、腫瘤、自身免疫病和移植免疫等［2－3］。作者此前已成功地將Sj26、Sj23和Sj14基因分別轉(zhuǎn)染至小鼠DC，并在DC中得到穩(wěn)定表達(dá)，聯(lián)合免疫具有明顯的協(xié)同或增強(qiáng)作用，本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)其保護(hù)性免疫機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 DC細(xì)胞株MTSC4（北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系陳慰峰教授惠贈(zèng)），常規(guī)方法培養(yǎng)傳代；BALB/c小鼠，6～8周齡、雌性（武漢市生物制品研究所）；小鼠白細(xì)胞介素－4（IL－4）和干擾素－γ（IFN－γ）檢測(cè)試劑盒（英國BD Biosciences Pharmingen公司）；噻唑藍(lán)MTT（美國Invitrogen公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（美國Bio－Rad公司）；RPMI－1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清（FCS，杭州四季青公司）。

1.2 方法

1.2.1Sj26基因轉(zhuǎn)染 DC、Sj23基因轉(zhuǎn)染 DC、Sj14基因轉(zhuǎn)染DC、pcDNA3轉(zhuǎn)染DC的制備與培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［4］制備，按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代。

1.2.2 動(dòng)物免疫 BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組，每組12只。A組為Sj26、Sj23、Sj14基因轉(zhuǎn)染DC，B組為Sj26基因轉(zhuǎn)染DC，C組為Sj23基因轉(zhuǎn)染DC，D組為Sj14基因轉(zhuǎn)染DC，E組為空質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染DC，F(xiàn)組為未處理DC，G組為RPMI－1640對(duì)照組。免疫前用RPMI－1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，0.25%胰蛋白酶分別消化各組DC，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL。A－F組，每只小鼠分別經(jīng)耳廓注射0.2 mL細(xì)胞懸液，G 組注射0.2mL RPMI－1640培養(yǎng)液。共免疫3次，間隔2w。末次免疫后第2w，每鼠經(jīng)皮膚感染40條日本血吸蟲尾蚴。

1.2.3 血清特異性IgG抗體檢測(cè) 收集初次免疫前、末次免疫后第2w以及攻擊感染后第6周各組小鼠血清，ELISA法檢測(cè)特異性IgG抗體?？扇苄韵x卵抗原（SEA）以10mg/mL包被酶標(biāo)板，待測(cè)血清稀釋度為1∶100，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG工作濃度為1∶1000，底物為鄰苯二胺，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A491）值。

1.2.4 血清細(xì)胞因子IFN－γ和IL－4檢測(cè) 按照IFN－γ和IL－4檢測(cè)試劑盒操作說明書，ELISA法分別檢測(cè)初次免疫前和末次免疫后第2w小鼠血清細(xì)胞因子水平。待測(cè)血清稀釋度為1∶10，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A450）值。根據(jù)同一酶標(biāo)板上的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。

1.2.5 IFN－γ和IL－4的誘生及檢測(cè) 攻擊感染后第6w，無菌取小鼠脾臟，常規(guī)法制備脾淋巴細(xì)胞懸液。以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/mL，加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1 mL/孔，每份樣本設(shè)3孔，分別加入RPMI－1640培養(yǎng)液、SEA（10μg/mL）和 ConA（5μg/mL），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72h，14 000×g離心10min，收集上清液。雙夾心ELISA法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生的IFN－γ和IL－4水平。

1.2.6 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將脾淋巴細(xì)胞加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)為2×105，200μL/孔，分別加入SEA（10μg/mL）和ConA（5μg/mL），同時(shí)設(shè)立 RPMI－1640培養(yǎng)液陰性對(duì)照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育72h，終止培養(yǎng)前，每孔加入MTT 10μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6h。吸去上清，加入DMSO 100μL/孔，振蕩以充分溶解甲肷產(chǎn)物，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A560）值。按公式計(jì)算刺激指數(shù)（SI），SI＝刺激孔A560均值/對(duì)照孔A560均值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 用SAS軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 血清特異性IgG抗體水平 末次免疫后第2 w，A－D組小鼠血清特異性IgG抗體水平較免疫前顯著升高，且明顯高于E和F組（P＜0.05）。感染后第6w，各組小鼠血清抗體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 血清IFN－γ水平 免疫后，A－D組小鼠IFN－γ水平較免疫前明顯增高（P＜0.01），且明顯高于E和F組（P＜0.01）（表2）。

表2 各組小鼠血清IFN－γ水平的比較Tab.2 Comparison of IFN－γlevels in sera from each group of mice

2.3 血清IL－4水平 免疫前、后各組小鼠血清IL－4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.4 脾淋巴細(xì)胞IFN－γ的誘生 A－D組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA和SEA刺激誘生的IFN－γ水平顯著高于G組（P＜0.001），E和F組在ConA和SEA刺激下產(chǎn)生的IFN－γ水平與G組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

2.5 脾淋巴細(xì)胞IL－4的誘生 A－D組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA和SEA刺激誘生的IL－4水平明顯低于G組（P＜0.001），E和F組在ConA和SEA刺激下產(chǎn)生的IL－4水平與G組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

2.6 脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù) 小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA和SEA刺激后的刺激指數(shù)，A－D組明顯高于G組（P＜0.001），E和F組的刺激指數(shù)與G組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表6）。

表3 各組小鼠血清IL－4水平的比較Tab.3 Comparison of IL－4levels in sera from each group of mice

表4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN－γ的誘生Tab.4 IFN－γresponses of spleen lymphocytes from each group of mice

表5 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞IL－4的誘生Tab.5 IL－4responses of spleen lymphocytes from each group of mice

表6 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)Tab.6 Stimulating index of spleen lymphocytes from each group of mice

3 討 論

日本血吸蟲病疫苗候選抗原可分為7大類，酶性抗原（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶）、肌球蛋白抗原（副肌球蛋白）、膜相關(guān)蛋白（Sj23）、鈣相關(guān)蛋白（脂肪酸結(jié)合蛋白、鈣蛋白酶、鈣網(wǎng)蛋白）、線粒體相關(guān)蛋白、性別相關(guān)蛋白、信號(hào)蛋白（Sj14－3－3）等［5］。迄今為止，單價(jià)抗感染疫苗候選分子誘導(dǎo)的保護(hù)力很少超過50%，究其因，一是由于血吸蟲感染后保護(hù)性免疫機(jī)制復(fù)雜多樣，包括體液免疫和細(xì)胞免疫，并有其它細(xì)胞和補(bǔ)體等的參與，不同的抗原分子誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫機(jī)制不同，而不同蟲期的保護(hù)性抗原的特異性亦不同，人們對(duì)于血吸蟲感染后的免疫機(jī)制目前尚不完全清楚；其二是血吸蟲是一種多細(xì)胞生物，且生活史復(fù)雜，抗原成分多樣，由于血吸蟲與宿主在長期共進(jìn)化過程中，產(chǎn)生了多種免疫逃避機(jī)制，使得疫苗的研制未能獲得理想效果；其三是由于DNA疫苗免疫原性較弱，對(duì)CD＋8T細(xì)胞和CD＋4T細(xì)胞的刺激作用均較弱［6］。

多價(jià)DNA疫苗可增加有效的抗原決定簇?cái)?shù)量，模擬血吸蟲自然感染，能刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的保護(hù)性抗體和激活更多效應(yīng)T細(xì)胞，獲得較好的免疫效果。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在刺激免疫反應(yīng)中起著核心作用，能刺激T淋巴細(xì)胞，尤其是初始T細(xì)胞。盡管DNA疫苗僅能直接轉(zhuǎn)染較小一部分的DC，但是實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在引流淋巴結(jié)中的所有DC均能被廣泛激活，從而為效應(yīng)T細(xì)胞的活化提供了最佳條件，DNA疫苗若能以DC為載體可望獲得良好的免疫效果［7］。因此，尋找新的疫苗候選分子、聯(lián)合一種或幾種有效抗原分子制成混合多價(jià)疫苗、結(jié)合佐劑的應(yīng)用等提高疫苗分子的免疫效果的研究，是當(dāng)前血吸蟲病疫苗研究的主攻方向［8］。

研究證實(shí)，機(jī)體抗血吸蟲感染的保護(hù)性免疫與Th1型細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)，發(fā)展以Th1型優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答為主的疫苗，將是高效血吸蟲病疫苗研制的關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明體液免疫和細(xì)胞免疫共同參與了DC DNA混合多價(jià)疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫作用，DC DNA混合多價(jià)疫苗誘導(dǎo)的抗日本血吸蟲感染的保護(hù)性免疫，與小鼠Th1型免疫應(yīng)答的增強(qiáng)有關(guān)，為血吸蟲病疫苗的研究打下了基礎(chǔ)。

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