日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育期蟲(chóng)卵內(nèi)抗氧化酶檢測(cè)的研究＊

薛偉世，曾慶仁，王 芳，張祖萍，喻鑫玲，何永康，李岳生，賀 美，李聞文

2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)教研室，長(zhǎng)沙 410013；

3.湖南省血吸蟲(chóng)病防治所診斷中心，岳陽(yáng) 414000

在日本血吸蟲(chóng)病病原診斷技術(shù)中，活檢結(jié)腸黏膜查蟲(chóng)卵是一種臨床上常用于檢查慢性和晚期病人的傳統(tǒng)方法，在應(yīng)用價(jià)值上，可彌補(bǔ)糞檢不足。血吸蟲(chóng)在人體的感染度，隨著防治深入而不斷下降，可見(jiàn)在臨床上采用活檢結(jié)腸黏膜查蟲(chóng)卵的方法來(lái)診斷血吸蟲(chóng)感染將會(huì)顯得越來(lái)越重要。但由于血吸蟲(chóng)感染者腸黏膜組織內(nèi)蟲(chóng)卵譜復(fù)雜，可見(jiàn)有成熟和未成熟卵與其結(jié)構(gòu)和顏色改變不同程度的蟲(chóng)卵，使得在活檢腸黏膜診斷中一直存在著判別蟲(chóng)卵死活的問(wèn)題未解決。依據(jù)前人研究，將腸黏膜所見(jiàn)蟲(chóng)卵其大致分為活卵、近期變性卵和遠(yuǎn)期變性卵三大類(lèi)來(lái)報(bào)告結(jié)果。這種依據(jù)蟲(chóng)卵形態(tài)學(xué)改變來(lái)判別蟲(chóng)卵死活的方法，不僅辨認(rèn)難度大，而且對(duì)絕大多數(shù)病例檢查報(bào)告的近期變性蟲(chóng)卵，只能給臨床帶來(lái)不能回答患者體內(nèi)是否有活蟲(chóng)體存在的確診問(wèn)題。為解決判別組織中蟲(chóng)卵死活問(wèn)題，在上世紀(jì)70年代，就有學(xué)者們先后研究發(fā)展了TTC－茚三酮染色氨基染色法、碘液染色法和丫啶橙熒光染色法，但在應(yīng)用中效果都不理想［1］。Giboda等（1994）［2］發(fā)現(xiàn) AKP可以作為蟲(chóng)卵生存力的標(biāo)志物。2011年本室王芳等［3］又進(jìn)一步研究報(bào)道了用AKP染色法對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染人和動(dòng)物腸黏膜組織內(nèi)蟲(chóng)卵作死活鑒別的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該酶染色法僅適用于對(duì)組織切片中蟲(chóng)卵的死活鑒別，而對(duì)完整蟲(chóng)卵的染色效果不佳。故對(duì)完整蟲(chóng)卵死活的鑒別方法問(wèn)題仍需探索解決。

抗氧化酶（antioxidant enzyme）是超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶等的統(tǒng)稱(chēng)，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，也是一組活性較高的酶。這些酶在血吸蟲(chóng)免疫逃避或/和免疫保護(hù)性研究中均已被證明其存在［4－8］，特別是在本研究之前探索中，采用抗氧化酶底物對(duì)血吸蟲(chóng)各發(fā)育階段及蟲(chóng)卵可溶性抗原進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其均富含有高水平的抗氧化酶（待發(fā)表資料）。為此，本研究為尋求一種實(shí)用于臨床應(yīng)用的簡(jiǎn)便方法，首次開(kāi)展了對(duì)日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育期蟲(chóng)卵和變性卵內(nèi)抗氧化酶水平的檢測(cè)分析，并獲得有意義的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 3，3－二甲基聯(lián)苯胺 （3，3′－Dimethylbenzidine，DAB）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。顯微圖像采集系統(tǒng)（Nikon Eclipse 80i）。

1.2 試驗(yàn)標(biāo)本的材料與來(lái)源 實(shí)驗(yàn)感染日本血吸蟲(chóng)小鼠模型建立：取健康昆明小鼠40只（購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部）。血吸蟲(chóng)陽(yáng)性釘螺（由湖南省血吸蟲(chóng)病防治所提供），常規(guī)釋放尾蚴，經(jīng)腹部去毛皮膚定量感染20±4尾/鼠。在感染后第45d，隨機(jī)分成4個(gè)模型組（感染后50d組、感染后90d組、治后30d組和治后90d組）。2治療組（16只鼠）均用吡喹酮（南京制藥廠有限公司產(chǎn)，批號(hào)20090401）灌胃，首日300mg/（kg·d）1次，次日再給同樣劑量治療1次。各模型鼠肝和腸來(lái)源蟲(chóng)卵標(biāo)本采集均按上述設(shè)計(jì)的分組時(shí)點(diǎn)進(jìn)行。蟲(chóng)卵標(biāo)本收集方法：解剖小鼠，灌注沖蟲(chóng)，從肝門(mén)脈－腸系膜血管查獲蟲(chóng)體以驗(yàn)證感染和治愈情況，分別收集肝組織和結(jié)腸組織。采用組織搗碎和過(guò)篩方法分離出鼠肝、腸組織內(nèi)蟲(chóng)卵，用于抗氧化酶染色條件探索和染色效果觀察。

1.3 抗氧化酶染色方法及實(shí)驗(yàn)條件的探索

1.3.1 DAB染色法的建立 采用3，3－二甲基聯(lián)苯胺（DAB）－過(guò)氧化氫（H2O2）底物顯色系統(tǒng)。操作方法為：將蟲(chóng)卵置于1.5mL EP管或載玻片上，加DAB顯色液200μL或50μL，在避光振蕩條件下作用20～30min后，加蒸餾水終止反應(yīng)，在顯微鏡下觀察結(jié)果，蟲(chóng)卵出現(xiàn)深棕色或深黃色者被判為陽(yáng)性。

1.3.2 DAB染色最佳反應(yīng)條件探索 取感染50d小鼠肝組織分離出新鮮游離蟲(chóng)卵做了兩方面條件的染色探索：振蕩染色和靜止染色的效果比較，將蟲(chóng)卵加DAB溶液后分連續(xù)振蕩反應(yīng)和靜止反應(yīng)兩組進(jìn)行比較觀察；染色不同時(shí)間的效果比較，將蟲(chóng)卵分為沸騰30min處理（以滅活其酶活性）和不處理兩部分，每部分涂3張玻片，觀察記錄蟲(chóng)卵形態(tài)，兩部分蟲(chóng)卵加DAB顯色劑后平行作10min、20min和30 min不同染色時(shí)間反應(yīng)，比較觀察的染色效果，以未處理新鮮活卵和沸騰處理卵的顯色反差最大者作為最佳染色條件。

1.4 DAB對(duì)不同發(fā)育期活卵和變性卵的染色效果分析 對(duì)取自各模型鼠的蟲(chóng)卵標(biāo)本，依據(jù)蟲(chóng)卵結(jié)構(gòu)和大小并參照文獻(xiàn)［1］標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)，將清晰可見(jiàn)毛蚴的蟲(chóng)卵判為成熟卵，不含毛蚴蟲(chóng)卵判為未成熟卵，卵內(nèi)出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)改變者被判為近期變性卵，出現(xiàn)鈣化的黑卵被判為遠(yuǎn)期變性卵。在DAB染色前后比較觀察各類(lèi)蟲(chóng)卵中出現(xiàn)的陽(yáng)性率與其著色反應(yīng)程度及部位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)不同類(lèi)型蟲(chóng)卵染色效果和對(duì)各模型鼠肝腸來(lái)源的蟲(chóng)卵檢測(cè)結(jié)果比較分析，均采用行×列表χ2檢驗(yàn)，使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)完整的游離蟲(chóng)卵染色的條件及效果分析用DAB底物顯色劑直接對(duì)來(lái)自肝組織來(lái)源的完整游離蟲(chóng)卵染色結(jié)果表現(xiàn)為棕黃色（圖1），與未用DAB染色的蟲(chóng)卵比，二者顏色反差顯著。對(duì)沸騰30min作酶滅活處理的蟲(chóng)卵染色作背景來(lái)比較觀察底物作用活卵不同時(shí)間點(diǎn)的染色效果（顏色反差和顯色卵數(shù)量）顯示，在室溫反應(yīng)30min時(shí)間為最佳（圖2）。與此同時(shí)，采用靜止和震動(dòng)兩種條件染色的效果，則以震動(dòng)條件下染色的為最佳。對(duì)不同發(fā)育程度蟲(chóng)卵的著色結(jié)果觀察（圖3）顯示，未成熟卵呈深棕色反應(yīng)，成熟卵呈淺棕黃色反應(yīng)，提示未成熟卵中的抗氧化酶水平或含量較成熟卵高。對(duì)變性蟲(chóng)卵染色（圖4）顯示，僅見(jiàn)近期變性卵中有部分卵呈顯色反應(yīng)，而在遠(yuǎn)期變性卵中未見(jiàn)有顏色改變。對(duì)血吸蟲(chóng)感染后兩個(gè)時(shí)點(diǎn)和經(jīng)吡喹酮治療后兩個(gè)時(shí)點(diǎn)的4組模型鼠肝、腸組織所分出的蟲(chóng)卵作抗氧化酶染色，結(jié)果分析顯示：蟲(chóng)卵顯色總陽(yáng)性率在感染后50d、90d組和治療后30d組分別為92.67%、46.03%和13.68%；而治療90d組則未查檢出顯色蟲(chóng)卵，見(jiàn)表1。此外，圖5顯示在血吸蟲(chóng)感染及治療鼠腸黏膜組織中蟲(chóng)卵染色發(fā)現(xiàn)，只要使蟲(chóng)卵充分暴露出組織則可獲得較理想效果，即活卵可顯強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，近期變性卵可顯較弱的陽(yáng)性反應(yīng)。

圖1 血吸蟲(chóng)完整新鮮活卵抗氧化酶染色與不染色的結(jié)果（100×）Fig.1 Antioxidase staining of S.japonicumfresh viable eggs（100×）

3 討 論

圖3 血吸蟲(chóng)未成熟卵和成熟卵的抗氧化酶染色結(jié)果（200×）Fig.3 Antioxidase activities of S.japonicumimmature eggs and mature eggs（200×）

圖4 感染鼠肝組織內(nèi)血吸蟲(chóng)近、遠(yuǎn)期變性卵的抗氧化酶染色結(jié)果（100×）Fig.4 Antioxidase staining of current and forward degradation eggs in S.japonicuminfected liver（100×）

一般而言，測(cè)定生物體內(nèi)生化代謝酶的活性可以反映出生物體的生理功能正常與否。一個(gè)生物體或細(xì)胞一旦死亡，其生化酶合成即終止，且在此前已合成的酶活性也將漸漸降低，并隨生物體變性而消失。這是本研究思路建立的依據(jù)，并在本研究之前開(kāi)展檢測(cè)感染鼠和治療鼠肝腸內(nèi)血吸蟲(chóng)卵堿性磷酸酶的結(jié)果也充分說(shuō)明了這一點(diǎn)［3］?？寡趸赶凳巧矬w內(nèi)廣泛存在的一組酶，就血吸蟲(chóng)而言在抵御宿主免疫細(xì)胞（包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞等）不斷產(chǎn)生的活性氧分子（ROS）方面以及在滿(mǎn)足自身正常生理功能方面也必然具有抗氧化酶。抗氧化酶中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（TPx）在吸蟲(chóng)體內(nèi)的存在均已被研究證實(shí)［4，7］，只有過(guò)氧化物酶（CAT）迄今未見(jiàn)在醫(yī)學(xué)吸蟲(chóng)中有研究發(fā)現(xiàn)。

圖5 鼠腸黏膜中血吸蟲(chóng)活卵和變性卵的抗氧化酶染色結(jié)果比較（100×）Fig.5 Antioxidase staining of viable eggs and degradation eggs in colonic mucous of mice（100×）

表1 Sj感染不同鼠模型肝腸組織內(nèi)分出的血吸蟲(chóng)卵抗氧化酶染色結(jié)果Tab.1 Differences of positive rate between the various types of eggs which are extracted from the enterohepatic circulation of mouse infected by S.japonicum

利用DAB＋H2O2作為抗氧化酶的底物（過(guò)氧化物和供氫體）顯色系統(tǒng)，其反應(yīng)原理是DAB可被過(guò)氧化物酶分解過(guò)氧化氫產(chǎn)生的氧所氧化，在過(guò)氧化物酶所在部位形成棕褐色沉淀，依據(jù)此原理建立的方法已在酶免疫組化中已被廣泛應(yīng)用。本研究將其用于對(duì)日本血吸蟲(chóng)完整蟲(chóng)卵直接染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：未成熟蟲(chóng)卵普遍呈深棕黃色；成熟卵多呈深黃色，分布于毛蚴體部；近期變性卵中部分有顯色反應(yīng)，且多為未成熟卵；遠(yuǎn)期變性卵和卵殼均無(wú)顯色反應(yīng)；對(duì)血吸蟲(chóng)感染50d鼠、90d鼠、感染第45d經(jīng)吡喹酮抗蟲(chóng)治療30d和90d共4組小鼠的肝、腸組織內(nèi)分離出的游離蟲(chóng)卵作抗氧化酶染色的結(jié)果（表1），其總陽(yáng)性率分別為92.67%、46.03%、13.68%和0.00%；在Sj感染后第50d小鼠肝腸組織內(nèi)蟲(chóng)卵的抗氧化酶染色陽(yáng)性率在各類(lèi)蟲(chóng)卵之間，未成熟卵的與成熟卵的差異無(wú)顯著性（χ2＝1.369，P＞0.05），成熟活卵和未成熟活卵與近期變性卵差異有高度顯著性（χ2＝3.423E2，P＝0.000），與遠(yuǎn)期變性卵差異更明顯；Sj感染后第50d小鼠肝腸組織內(nèi)蟲(chóng)卵的抗氧化酶染色陽(yáng)性率與感染后第90d之間，差異有高度的顯著性（χ2＝2.413E3，P＝0.000）。這些結(jié)果揭示：血吸蟲(chóng)活卵內(nèi)富含抗氧化酶成分，其中以未成熟卵內(nèi)的水平或含量為最高，并有隨著蟲(chóng)卵成熟到死亡而含量漸漸減少，消失于蟲(chóng)卵完全變性的鈣化卵。由此提示，檢測(cè)血吸蟲(chóng)卵內(nèi)抗氧化酶可作為判別蟲(chóng)卵死與活的標(biāo)志物之一，但是否可用于臨床活檢患者腸黏膜內(nèi)的蟲(chóng)卵鑒別死活，則有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

至于采用DAB＋H2O2底物系統(tǒng)對(duì)蟲(chóng)卵作抗氧化酶染色的酶是屬何種氧化酶的問(wèn)題，在本研究中尚未做研究鑒定。據(jù)研究報(bào)道：Roche等［7，9］發(fā)現(xiàn)曼氏血吸蟲(chóng)GPx主要定位與卵黃腺和蟲(chóng)卵，并提示與蟲(chóng)卵的形成有關(guān)；Kumagai等［6］對(duì)日本血吸蟲(chóng)的發(fā)現(xiàn)證實(shí)PRx－1（抗氧化蛋白－1）主要存在于蟲(chóng)卵毛蚴表面、卵殼和毛蚴之間以及鄰近蟲(chóng)卵的宿主組織中，而PRx－2位于蟲(chóng)卵毛蚴內(nèi)。本研究用DAB反應(yīng)顯色的部位主要在發(fā)育中卵胚中和成熟的毛蚴體部。由此推測(cè)，可能含有多種氧化酶在內(nèi)。

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