腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建及在清開(kāi)靈注射液致敏性研究中的應(yīng)用

王 宏，劉兆華，杜 武，劉兆平

(山東大學(xué)藥學(xué)院1.藥理學(xué)系，2.新藥評(píng)價(jià)中心藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250012)

清開(kāi)靈注射液(Qingkailing Injection，QKLI)是由膽酸、珍珠母(粉)、豬去氧膽酸、梔子、水牛角(粉)、板藍(lán)根、黃芩苷和金銀花制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、化痰通絡(luò)和醒神開(kāi)竅之功效，用于熱病、神昏、中風(fēng)偏癱和神志不清，也可用于急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、腦血栓和腦出血等的治療。隨著QKLI臨床應(yīng)用的日益廣泛，不良反應(yīng)尤其是過(guò)敏反應(yīng)的報(bào)道日益增多［1－2］，嚴(yán)重阻礙了其生產(chǎn)和應(yīng)用。確定致敏原、明確致敏機(jī)制是提高QKLI臨床用藥安全性的有效方法。QKLI成分復(fù)雜，其中含有的許多小分子物質(zhì)如綠原酸、黃芩苷和一些相對(duì)分子質(zhì)量較小的結(jié)合型氨基酸等均為可疑的致敏物質(zhì)［3－5］。大量實(shí)驗(yàn)表明，傳統(tǒng)的過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)方法如主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)、主動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)等對(duì)大分子蛋白類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果與臨床有較好的一致性，而對(duì)小分子物質(zhì)易產(chǎn)生假陰性結(jié)果［6］。因此，迫切需要新的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)QKLI的致敏性進(jìn)行研究。

腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn) (popliteal lymph node assay，PLNA)是近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道較多的可用于小分子物質(zhì)致敏性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法［7－8］，對(duì)多個(gè)已知的對(duì)人體具有免疫刺激作用的化合物的研究顯示，PLNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床不良反應(yīng)發(fā)生率之間具有較高的相關(guān)性［9］。鹽酸 D-青霉胺(D-penicillamine hydrochloride，D-Pen)是臨床不良反應(yīng)發(fā)生率較高的一種小分子物質(zhì)，國(guó)外研究者多用其作為PLNA建模的陽(yáng)性藥物［10－11］，本研究以 D-Pen為陽(yáng)性對(duì)照藥，以苯巴比妥(phenobarbital，PB)為陰性對(duì)照藥，通過(guò)對(duì)D-Pen量效關(guān)系和腘窩淋巴結(jié)(popliteal lymph node，PLN)時(shí)效的研究，選擇D-pen的最低有效劑量和最佳解剖時(shí)間，復(fù)制直接法 PLNA(direct PLNA，d-PLNA)和間接法 PLNA(secondary PLNA，s-PLNA)模型，并檢測(cè)QKLI的致敏性。通過(guò)比較小鼠給藥側(cè)和未給藥側(cè)PLN的反應(yīng)情況，推測(cè)QKLI的致敏可能性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌性，7～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(魯)20090001。小鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。自由飲水?dāng)z食，溫度21～23℃，相對(duì)濕度45% ～55%，12 h明/12 h暗。

1.2 藥物、試劑和儀器

D-Pen，美國(guó)MP Biomedicals公司，用生理鹽水溶解，用前過(guò)濾除菌;PB，美國(guó)Internal Laboratory公司，批號(hào)2300605，用20%DMSO+80%生理鹽水溶解;QKLI，每支2 ml，河北神威藥業(yè)有限公司，批號(hào)10062652;磷酸鹽緩沖液(PBS)，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，新西蘭Gibco公司;DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，美國(guó)Solarbio公司。CytoreconTMCYT-1000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國(guó)Effector Cell Institute公司;ME235P型分析天平，德國(guó)賽多利斯公司;Eppendorf Minispin離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 清開(kāi)靈注射液的制備

由于清開(kāi)靈粉針劑已經(jīng)停產(chǎn)，為了制得較高濃度的QKLI，將市售 QKLI進(jìn)行凍干，方法如下:將QKLI轉(zhuǎn)移至西林瓶后，在－80℃冰箱放置24 h，隨即采用冷凍干燥法，獲得凍干粉，然后用適量注射用水溶解，制備2倍和4倍原液濃度的QKLI。

1.4 D-Pen量效關(guān)系和PLN反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定

小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照、D-Pen 12.5，25.0，37.5，50.0 和 62.5 mg·kg－1和 PB 50 mg·kg－1組，每組10只。將配置好的D-Pen和PB過(guò)濾除菌，一次性sc給予小鼠右側(cè)后肢足趾部，進(jìn)針?lè)较蛴勺愀赶蜃慵?，給藥體積均為每只50μl;左側(cè)不做任何處理。正常對(duì)照組sc給予生理鹽水。分別于給藥后第5，7和9天處死小鼠，75%乙醇浸泡10 min，入無(wú)菌操作間，分離并摘取左、右兩側(cè)PLN，剔除周?chē)竞徒Y(jié)締組織，然后迅速放入冰浴的含1%FBS的PBS(1%FBS-PBS)中，取出稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算PLN質(zhì)量指數(shù)(mass index，MI)，MI=PLN 質(zhì)量(處理側(cè))(mg)/PLN質(zhì)量(未處理側(cè))(mg)。將每側(cè)淋巴結(jié)分別放在200目不銹鋼網(wǎng)上，用小杵輕輕研磨的同時(shí)用冰浴的1%FBS-PBS沖洗至小培養(yǎng)皿中，收集細(xì)胞懸液，310×g離心5 min，棄上清，洗滌1次，將細(xì)胞重懸于0.5 ml冰浴的1%FBS-PBS中，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算PLN的細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)，CI=PLN(處理側(cè))細(xì)胞數(shù)/PLN(未處理側(cè))細(xì)胞數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇D-Pen的最低有效劑量和最佳解剖時(shí)間，為采用d-PLNA和s-PLNA進(jìn)行藥物檢測(cè)時(shí)給藥劑量和解剖時(shí)間的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.5 直接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)檢測(cè)清開(kāi)靈注射液的致敏性

小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、D-Pen 37.5 mg·kg－1組、PB 50.0 mg·kg－1組、QKLI原液、2 倍和4 倍原液濃度組，每組10只。分別在小鼠右側(cè)后肢足趾部一次性sc 50μl上述藥物，左側(cè)不做任何處理。正常對(duì)照組給予生理鹽水。給藥后第7天，處死小鼠，按1.4方法解剖，取PLN，稱(chēng)重，研磨，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)算MI和CI。

1.6 間接腘窩淋巴結(jié)試驗(yàn)檢測(cè)清開(kāi)靈注射液的致敏性

小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、D-Pen 37.5 mg·kg－1組、PB 50 mg·kg－1組、2 倍和 4 倍 QKLI原液濃度組，小鼠右側(cè)后肢足趾部一次性sc給予50μl上述藥物，左側(cè)不做任何處理。2個(gè)月后，同一小鼠的同側(cè)足趾 sc 給予 D-Pen 25 mg·kg－1，PB 25 mg·kg－1，2倍和4倍QKLI原液濃度組注射QKLI原液進(jìn)行激發(fā)，正常對(duì)照組sc給予生理鹽水。激發(fā)后第7天處死小鼠，按1.4方法解剖，取PLN，稱(chēng)重，研磨，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)算MI和CI。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 D-Pen最低有效劑量和最佳解剖時(shí)間的選擇

由表1可見(jiàn)，單次足趾部sc給予D-Pen后第7天，D-Pen 37.5，50.0 和62.5 mg·kg－1組處理側(cè) PLN質(zhì)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于未處理側(cè)(P＜0.05，P＜0.01)，MI和 CI顯著升高，達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(平均 MI≥2，CI≥5)，且高于正常對(duì)照組(P ＜0.05，P ＜0.01)。D-Pen 25 mg·kg－1組處理側(cè)PLN質(zhì)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)較未處理側(cè)亦升高(P＜0.05)，但MI和 CI未達(dá)到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。上述結(jié)果提示，D-Pen 的最低有效劑量為 37.5 mg·kg－1。

PLN時(shí)效關(guān)系分析顯示(表2)，sc給予D-Pen 37.5 mg·kg－1后第 7 天，其 MI和 CI均達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，而給藥后第5和9天MI和CI未達(dá)到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，提示最佳解剖時(shí)間為給藥后第7天。

Tab.1 Dose-dependent response of D-penicillamine hydrochloride(D-Pen)inducing popliteal lymph node(PLN)response

Tab.2 Time-dependent reaction of D-Pen hydrochloride in popliteal lymph node(PLN)

2.2 QKLI對(duì)d-PLNA小鼠PLN反應(yīng)的影響

由表3 可見(jiàn)，與未處理側(cè)相比，PB 50 mg·kg－1組處理側(cè)PLN質(zhì)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著變化。D-Pen 37.5 mg·kg－1組、2 倍和4 倍 QKLI原液濃度組處理側(cè)PLN質(zhì)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于未處理側(cè)(P＜0.01)，與正常對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)，MI和CI顯著升高，達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn);QKLI原液組(QKLI×1)處理側(cè)PLN的質(zhì)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)較未處理側(cè)亦升高(P ＜0.05)，且高于正常對(duì)照組(P ＜0.05，P ＜0.01)，但MI和CI未達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 QKLI對(duì)s-PLNA小鼠PLN反應(yīng)的影響

由表4可見(jiàn)，足趾部sc低于有效劑量的藥物進(jìn)行激發(fā)后，PB組處理側(cè)PLN質(zhì)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)與未處理側(cè)相比無(wú)顯著變化，與正常對(duì)照組相比，亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D-Pen組、2倍和4倍QKLI原液濃度組處理側(cè)PLN質(zhì)量和細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于未處理側(cè)(P ＜0.01)，且高于正常對(duì)照組(P ＜0.01)，MI和CI達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)。

Tab.3 Effect of Qingkailing injection(QKLI)on PLN response of mice in direct popliteal lymph node assay

Tab.4 Effect of QKLI on PLN response of mice in secondary popliteal lymph node assay

3 討論

PLNA是一種較為可靠的檢測(cè)注射用小分子藥物致敏性的實(shí)驗(yàn)方法，其發(fā)生機(jī)制可能與危險(xiǎn)假說(shuō)和半抗原假說(shuō)有關(guān)，即小分子化合物可能通過(guò)提供危險(xiǎn)信號(hào)或作為半抗原的方式激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。小鼠足趾部sc給藥后，通過(guò)檢測(cè)局部引流PLN的MI和CI的變化情況，可以推測(cè)受試物的致敏潛能。

d-PLNA是將受試物直接注入小鼠后肢足趾部皮下，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，且能進(jìn)行量效關(guān)系研究，是評(píng)價(jià)小分子化合物免疫刺激潛能的較為理想的實(shí)驗(yàn)方法，但是不能區(qū)分受試物引起的陽(yáng)性反應(yīng)是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)還是由刺激性因素引起的炎癥反應(yīng)［13－15］。s-PLNA是用有效劑量的受試物致敏小鼠，一段時(shí)間(數(shù)周至數(shù)月)后，當(dāng)處理側(cè)的PLN與未處理側(cè)相比無(wú)顯著性差異后，再用低于有效劑量的同一受試物進(jìn)行激發(fā)，若受試物能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，則激發(fā)后能引起處理側(cè)PLN中淋巴細(xì)胞的活化與增殖，進(jìn)而引起PLN質(zhì)量和細(xì)胞數(shù)目的增多，達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)［16－17］;若受試物的作用僅為刺激性因素引起的炎癥反應(yīng)，則用激發(fā)劑量的藥量激發(fā)后不能引起PLN陽(yáng)性反應(yīng)。因此，s-PLNA能夠克服d-PLNA不能研究反應(yīng)機(jī)制的不足。本研究將d-PLNA和s-PLNA聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行QKLI致敏性檢測(cè)。

通過(guò)對(duì)陽(yáng)性對(duì)照藥D-Pen量效關(guān)系和PLN反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，本研究確定了D-Pen的最低有效劑量為37.5 mg·kg－1，最佳解剖時(shí)間為藥后第7 天，為d-PLNA陽(yáng)性藥物給藥劑量與解剖時(shí)間的選擇和s-PLNA給藥劑量及激發(fā)劑量與解剖時(shí)間的選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

d-PLNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2倍和4倍原液濃度的QKLI可誘導(dǎo)BALB/c小鼠發(fā)生明顯的PLN反應(yīng)，表現(xiàn)為MI和CI明顯升高，且達(dá)到陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，提示QKLI具有一定的致敏潛能。為了進(jìn)一步研究其具體機(jī)制，本研究應(yīng)用s-PLNA對(duì)2倍和4倍原液濃度的QKLI進(jìn)行檢測(cè)。首次致敏2個(gè)月后，用不能引起PLNA陽(yáng)性反應(yīng)的QKLI原液進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后第7天解剖，MI和CI均達(dá)到了陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，表明較高濃度的QKLI能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，QKLI中可能存在某些小分子致敏性成分，這些成分達(dá)到一定的濃度時(shí)能夠誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。但是，QKLI成分復(fù)雜，具體引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的小分子成分尚不清楚，有待今后進(jìn)一步研究。

中藥注射劑的安全性問(wèn)題是制約其應(yīng)用與發(fā)展的瓶頸，PLNA為中藥注射劑小分子致敏原的篩選提供了有效途徑，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

［1］Wang QW， Li D， Feng ZH. Adverse drug reactions induced by Qingkailing injection:an analysis of 287 cases［J］.Eval Anal Drug-Use in Hosp China(中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析)，2010，10(7):652-654.

［2］Yu DH， Li B， Cheng M. Analysis of 34 cases with adverse drug reactions of Qingkailing Injection［J］.China Licensed Pharmacist(中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師)，2010，7(12):6-8.

［3］Liu YP. Adverse reactions of traditional Chinese medicines in 111 cases［J］.Adverse Drug Reactions J(藥物不良反應(yīng)雜志)，2000，2(2):94-97.

［4］He Z，Qu HH，Wang XQ，ZhaoY，Li YF，Hu LN，et al.Allergenicity of chlorogenic acid as hapten［J］.J Beijing Univ Tradit Chin Med(北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2010，33(10):667-669，680.

［5］Tong L.The relationship of adverse reactions of Shuanghuanglian Injection with its components［J］，Chin Tradit Pat Med(中成藥)，1997，19(4):47－48.

［6］Choquet-Kastylevsky G， Descotes J. Value of animal models for predicting hypersensitivity reactions to medicinal products［J］.Toxicology，1998，129(1):27-35.

［7］L?vik M，Alberg T，Nygaard UC，Samuelsen M，Groeng EC，Gaarder PI.Popliteal lymph node(PLN)assay to study adjuvant effects on respiratory allergy［J］.Methods，2007，41(1):72-79.

［8］Shinkai K，Nakamura K，Tsutsui N，Kuninishi Y，Iwaki Y，Nishida H，et al.Mouse popliteal lymph node assay for assessment of allergic and autoimmunity-inducing potentials of low-molecular-weight drugs［J］.J Toxicol Sci，1999，24(2):95-102.

［9］Pieters R.The popliteal lymph node assay:a tool for predicting drug allergies［J］.Toxicology，2001，158(1-2):65-69.

［10］Aida T，Kimura T，Ishikawa N，Shinkai K.Evaluation of allergenic potential of low-molecular compounds by mouse popliteal lymph node assay［J］.J Toxicol Sci，1998，23(5):425-432.

［11］Nierkens S，Aalbers M，Bleumink R，Boon L，Pieters R.Drug-induced type 1 and type 2 immune responses are characterized by distinct profiles of cell kinetics，cytokine production，and expression of co-stimulatory molecules in the popliteal lymph node assay［J］.J Immunotoxicol，2005，2(3):141-150.

［12］Ravel G，Descotes J.Popliteal lymph node assay:facts and perspectives［J］.J Appl Toxicol，2005，25(6):451-458.

［13］Gutting BW，Schomaker SJ，Kaplan AH，Amacher DE.A comparison of the direct and reporter antigen popliteal lymph node assay for the detection of immunomodulation by low molecular weight compounds［J］.Toxicol Sci，1999，51(1):71-79.

［14］Choquet-Kastylevsky G， Descotes J. Popliteal lymph node responses to acetone and ethanol differ from those induced by streptozotocin［J］.Arch Toxicol，2004，78(11):649-654.

［15］Ravel G，Christ M，Horand F，Descotes J.Cytokine release does not improve the sensitivity and specificity of the direct popliteal lymph node assay［J］.Toxicology，2004，200(2-3):247-254.

［16］Friedrich K，Delgado IF，Santos LM，Paumgartten FJ.Assessment of sensitization potential of monoterpenes using the rat popliteal lymph node assay［J］.Food Chem Toxicol，2007，45(8):1516-1522.

［17］Liu ZH， Liu ZP， Zhou GY. Application of popliteal lymph node assay in study of drug hypersensitivity［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2009，23(1):70-75.