Liguzinediol的正性肌力作用機制及心臟安全性

徐 毅，羅卓卡，劉泉明，黃霏霏，李雪華，劉 磊，李 偉，陳 龍，4

(南京中醫(yī)藥大學藥學院1.藥理學教研室，2.中藥化學教研室，江蘇南京 210046;3.吳江市第一人民醫(yī)院，江蘇吳江 215200;4.泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇泰州 225300)

2，5-二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪(liguzinediol，LZDO)，是對川芎嗪(ligustrazine)進行結(jié)構(gòu)修飾而獲得的水溶性化合物。前期研究表明，LZDO能增加大鼠在體和離體的心臟收縮力［1－2］。急性毒性實驗表明，雄性小鼠尾靜脈給藥的LD50為1.692 g·kg－1［3］;藥物代謝動力學表明，LZDO具有良好的成藥性，LZDO血藥濃度(c)-時間(t)曲線呈二室模型，該藥物可能通過肝藥酶代謝［4］。本研究在此基礎(chǔ)上，對LZDO正性肌力的作用機制進行初步探討，并通過觀察LZDO對豚鼠P-R間期，校正QT間期(QTc)間期，人類心臟鈉通道(human cardiac sodium channel，hNav1.5)電流和人類果蠅相關(guān)基因(human ether-ago-go related gene，hERG)編碼的鉀電流的影響評價其心臟安全性。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Liguzinediol自制(純度為 99.3%，結(jié)構(gòu)經(jīng)UV，IR，NMR 和 EI-MS 確證)［1－2］。尼莫地平(nimodipine，Nim)與 rethenium red均購自 sigma公司;RM6240B/C(四道)型多道生理記錄儀，YP J01型壓力換能器和HSS-1(B)型恒溫浴槽均為成都儀器廠生產(chǎn)。膜片鉗放大器(200B)，數(shù)字-信號轉(zhuǎn)換器(Digidata 1322A)和pClamp9.0軟件均為美國Axon Instruments公司生產(chǎn)。微電極拉制儀(P-97)為美國Sutter Instrument公司生產(chǎn)。其他試劑均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 大鼠離體心臟實驗

健康清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，動物使用許可證:SYXK(蘇)2002-0053。大鼠ip給予20%烏拉坦5 ml·kg－1麻醉，快速開胸取出心臟，置于0～4℃灌流液中使之停搏，修剪分離主動脈，行主動脈插管后，采用 Langendorff裝置，充氧(95%O2+5%CO2)條件下，灌流系統(tǒng)經(jīng)主動脈行離體心臟灌流 (mmol·L－1:NaCl 117，KCl 5.7，CaCl21.8，MgCl21.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，HEPES20，葡萄糖11)，用NaOH調(diào)至7.4，溫度為(37.5 ± 0.5)℃，灌流壓 80 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)。采用插管法將壓力感受器探頭經(jīng)左心房插入左心室，經(jīng)壓力換能器與RM6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)相連用于記錄左心室收縮曲線。按照灌流液 (空白對照)→LZDO 100μmol·L－1→洗脫的順序灌流，持續(xù)5 min并于灌流5 min末記錄大鼠離體心臟左心室的各項心功能參數(shù)。再按照灌流液→Nim 1 μmol·L－1或 rethenium red 5 μmol·L－1→Nim 1 μmol·L－1+LZDO 100 μmol·L－1或 rethenium red 5 μmol·L－1+LZDO 100 μmol·L－1的順序灌流。上一劑量灌流結(jié)束隨后灌流下一劑量，每一組灌流持續(xù)5 min，分別記錄各濃度組給藥5 min后的左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大升降速率(maximum rate of rise/decrease of left ventricular pressure，±d p/d tmax)和心率(heart rate，HR)。

1.3 豚鼠離體和在體心電圖實驗

1.3.1 豚鼠在體實驗

10只豚鼠，體質(zhì)量250 ～300 g，雌雄不拘，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2002-0053。豚鼠ip給予20%烏拉坦(5 ml·kg－1)麻醉，仰臥位固定，針形電極引導記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，經(jīng)四道生理記錄儀采樣并存入計算機。10只豚鼠分為2組，每組5只，分別經(jīng)頸外靜脈緩慢推注生理鹽水或 LZDO 1.7 g·kg－1(LZDO被溶解在1 ml的生理鹽水中)，持續(xù)5 min。給藥前留有5 min平衡時間，于處理后5 min記錄心電圖，分析P-R間期及QTc間期。QTc=QT/RR間期的平方根［5］。

1.3.2 豚鼠離體實驗

豚鼠離體心臟灌流同1.2。將3個電極分別置于心尖、右心室游離壁和主動脈根部。按照灌流液(空白對照)→LZDO 300 μmol·L－1順序灌流，每一灌流持續(xù)5 min，給藥5 min后記錄離體心臟心電圖并分析其P-R及QTc間期。

1.4 膜片鉗全細胞方法記錄細胞膜離子電流［6］

1.4.1 記錄大鼠左心室肌細胞L型鈣電流

采用常規(guī)大鼠心肌細胞分離方法［6］分離心肌細胞。在室溫(20～22℃)下進行。細胞外灌流液為(mmol·L－1):NaCl 138，KCl 9，CaCl21，MgCl21，TEA-Cl 10，HEPES 10，用 NaOH 調(diào)至 7.4。電極(阻抗約為 5 MΩ)內(nèi)液為(mmol·L－1):CsCl 130，MgCl22，EGTA 11，葡萄糖10，HEPES20，Na2ATP 2，GTP 0.1，用CsOH調(diào)至7.4。電壓由－80 mV階躍到－40 mV維持30 ms，然后由 －40 mV階躍到0 mV維持300 ms，最后恢復到－80 mV。電流信號由與計算機相連的膜片鉗放大器(Axon Instruments 200B，USA)放大并經(jīng)數(shù)字-信號轉(zhuǎn)換器與計算機對話，信號的發(fā)放和采集均由pClamp9.0軟件完成，并將數(shù)據(jù)存儲于硬盤內(nèi)。按照灌流液(空白對照)→Nim 2 μmol·L－1順序灌流左心室肌細胞，觀察所記錄的電流。另一組實驗按照灌流液→LZDO 100μmol·L－1順序灌流，于灌流 5 min末記錄其 5個細胞L型鈣電流。

1.4.2 記錄 hNav1.5 電流

合成的 hNav1.5 cDNA(NM_000335.4)被克隆到帶有G418耐藥性的表達載體pcDNA3.1上。構(gòu)成的質(zhì)粒在脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑作用下，轉(zhuǎn)染到無內(nèi)源性 hNav1.5通道表達的 HEK細胞系中。hNav1.5細胞株通過規(guī)范的次代培養(yǎng)以維持最適宜的狀態(tài)，并且DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)(10%小牛血清和G418 250 mg·L－1)。穩(wěn)定表達 hNav1.5 通道的HEK293細胞，培養(yǎng)于35 mm培養(yǎng)皿中，在37℃/5%CO2培養(yǎng)箱中放置至少24 h后用于實驗。hNav1.5 HEK細胞系被廣泛應(yīng)用于hNav1.5通道的研究中［7－8］。記錄外液(mmol·L－1:NaCl 25，TEA-Cl 122，MgCl21，葡萄糖10，HEPES10，CaCl21.8)，pH用NaOH調(diào)至 7.4，用蔗糖將滲透壓值調(diào)至290 mOsm。記錄內(nèi)液(mmol·L－1:CsF 129，MgCl22，EGTA 11，HEPES 10，Na2ATP 3)，pH 用CsOH 調(diào)至7.2，用蔗糖將滲透壓值調(diào)至277 mOsm。鉗制電壓為－80 mV，階躍到－20 mV維持20 ms。按照灌流液(空白對照)→LZDO 1→10→100→300 μmol·L－1的順序灌流，于灌流5 min末記錄其5個細胞的電流。

1.4.3 記錄 hERG 電流

合成的hERGcDNA(NM_000238.2)被克隆到帶有G418耐藥性的表達載體pcDNA3.1上，其他步驟同1.4.2 細胞株的制備。記錄外液(mmol·L－1):NaCl 137，MgCl21.2，KCl 5.4，葡萄糖10，HEPES10，CaCl22，pH用NaOH調(diào)至7.4，用蔗糖將滲透壓值調(diào)至 290 mOsm。記錄內(nèi)液(mmol·L－1):KCl 130，MgCl21，HEPES10，Mg-ATP 5，EGTA 5，GTP 0.1，pH用 KOH調(diào)至 7.3，用蔗糖將滲透壓值調(diào)至290 mOsm。鉗制電壓為－80 mV，階躍到－50 mV維持50 ms，然后施加到50 mV 4800 ms試驗電壓，最后施加到－50 mV 5000 ms試驗電壓。按照灌流液(空白對照)→LZDO 1→10→100→300 μmol·L－1的順序灌流，于灌流5 min末記錄其5個細胞的電流。

1.5 激光共聚焦測定左心室心肌細胞鈣釋放［9］

急性分離大鼠左心室心肌細胞［6］。細胞在37℃條件下，與 Fluo-3(5 μmol·L－1)共孵育30 min，用灌流液(同1.2灌流液)清洗5次，除去殘留的Fluo-3。加載好熒光染料的細胞(選用橫紋清楚、呈桿狀、無收縮的細胞)置于Zeiss LSM 710倒置共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的載物臺上。0.5 Hz的局部場刺激由電子刺激器通過一對刺激電極以1.5倍閾強度的脈沖實施，從而觸發(fā)細胞產(chǎn)生鈣瞬變。共聚焦顯微鏡的成像方式為線掃描，采樣速率為2 ms/線，共聚焦線掃描在局部場刺激開始前200 ms即開始，起始部分作為刺激前的本底對照。按照灌流液(空白對照)→LZDO 100 μmol·L－1的順序灌流，分別于灌流LZDO 前及后 30 s，1，1.5，2，3，5，10，15，20，25，30，35，40 min末記錄其5個細胞的鈣瞬變。選擇2 min(大約為鈣瞬變最大值的開始時間點)和30 min(大約為鈣瞬變最大值的末期)為分析點。實驗獲得圖像用IDL程序處理，鈣瞬變的大小以標準熒光強度(F)/F0表示，其中F0為靜息狀態(tài)熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 LZDO對大鼠離體心臟和心肌電生理的影響

大鼠離體心臟收縮力(表 1)表明，LZDO 100 μmol·L－1能顯著性增加LVSP，LVEDP 和±d p/d tmax，但對HR無影響，洗脫后出現(xiàn)部分回復。Nim 1 μmol· L－1+LZDO 或 rethenium red 5 μmol·L－1+LZDO同時灌入，LVSP，LVEDP，±d p/d tmax顯著降低，與單用Nim或rethenium red作用相當，說明 Nim或 rethenium red可阻斷 LZDO 100 μmol·L－1的正性肌力作用。

2.2 LZDO對豚鼠在體和離體心臟P-R間期及QTc間期的影響

豚鼠在體心電圖(圖1A)顯示，生理鹽水組和LZDO 1.7 g·kg－1組的 P-R 間期分別為(60 ±5)ms和(59±40)ms，QTc間期分別為(248±20)ms和(250±18)ms，兩者間均無顯著差異。

Tab.1 Effect of liguzinediol(LZDO)on positive inotropy in isolated rat hearts

豚鼠離體心電圖(圖1B)顯示，空白對照和LZDO 300 μmol·L－1灌流的P-R 間期分別為(79±15)ms和(80±20)ms;QTc間期分別為(310±19)ms和(312±17)ms，兩種灌流無顯著性差異。

Fig.1 Effects of LZDO on P-R and QTc of guinea pig ECG in vivo(A)and in vitro(B).

2.3 LZDO對正常大鼠左心室肌細胞L型鈣電流的作用

Nim 2 μmol·L－1能完全阻斷所記錄的電流，表明該電流為L型鈣電流(圖2A)。LZDO 100μmol·L－1對L型鈣電流無顯著性作用(圖2B數(shù)據(jù)未顯示)。

Fig.2 Effcet of LZDO on L-type Ca2+current from adult rat left ventricular myocyte.

2.4 LZDO對hNav1.5和hERG電流的影響

圖3 和圖 4可見，LZDO 1，10，100和300 μmol·L－1對 hNav1.5 和 hERG 電流無顯著性的抑制作用。對照組 hNav1.5電流為(3920±442)pA，LZDO 1，10，100 和300 μmol·L－1組分別為3724±259，3656±346，3564±253和(3513±231)pA，與對照組無顯著差異。對照組hERG電流為 (1205 ± 25)pA，LZDO 1， 10， 100 和300 μmol·L－1分別為1151±24，1106 ±24，1086±75和(1022±10)pA，與對照組無顯著差異。

Fig.3 Effect of LZDO on hNav1.5 current.

Fig.4 Effect of LZDO on hERG current.

2.5 LZDO對大鼠左心室心肌細胞鈣釋放的影響

圖5 表明，LZDO 100 μmol·L－1能明顯增加大鼠左心室心肌細胞的鈣釋放量，2 min和30 min從標準化的對照組(100±4)%增加到(138±7)%及(139±12)%(n=5，P ＜0.05)。LZDO 增加心肌細胞鈣釋放的作用持續(xù)到30 min。而且 LZDO 100μmol·L－1未影響鈣釋放的基礎(chǔ)水平。

Fig.5 Effect of LZDO on intracellular Ca2+transients in adult rat left ventricular myocyte.

3 討論

本實驗結(jié)果表明，LZDO增加大鼠左心室收縮力的作用與肌漿網(wǎng)的鈣釋放有關(guān)。LZDO并沒有顯著性改變豚鼠在體與離體心電圖的P-R間期及QTc間期，LZDO 300 μmol·L－1并沒有顯著性抑制 hNa1.5和hERG電流，在心臟安全性評價實驗中LZDO無致心律失常的作用。

本研究在前期研究工作［1］的基礎(chǔ)上，證明LZDO對L型鈣電流并無直接的作用，而L型鈣通道又能介導LZDO的正性肌力作用，表明從L型鈣通道活動到心肌收縮的鏈條中，LZDO作用于L型鈣通道的下游。該鏈條可表述為動作電位到達心肌細胞膜→引起心肌細胞去極化→L型鈣通道開發(fā)并導致Ca2+內(nèi)流→內(nèi)流的少量Ca2+引起肌漿網(wǎng)(SR)膜上的蘭尼堿受體(ryanodine receptor，RyR)開放→鈣誘導性鈣釋放(calcium-induced calcium release，CICR)→釋放大量的Ca2+→肌漿網(wǎng)的Ca2+濃度下降→肌漿網(wǎng)膜上的鈣泵(SR-Ca2+ATPase)活動→Ca2+重新泵入肌漿網(wǎng)中［10－11］。增加L型鈣電流或者激活RyR可增加肌漿網(wǎng)鈣釋放［12－13］。L型鈣通道阻滯劑Nim阻斷了LZDO的正性肌力作用，是由于Nim阻斷了CICR的過程，結(jié)合LZDO對L型鈣電流無作用的實驗結(jié)果，判斷L型鈣通道不是LZDO發(fā)揮正性肌力作用的靶點。本實驗rethenium red通過阻斷肌漿網(wǎng)鈣釋放的最后過程，使LZDO無法發(fā)揮正性肌力作用，說明LZDO發(fā)揮正性肌力的作用與肌漿網(wǎng)鈣釋放有關(guān)。大鼠左心室心肌細胞鈣釋放實驗表明，LZDO 100 μmol·L－1能明顯增加心肌細胞鈣釋放，并能持續(xù)到30 min。本研究表明，LZDO作用靶點不在L型鈣通道，對L型鈣通道并無直接作用，但L型鈣通道被阻斷后，CICR過程也無法實現(xiàn)，LZDO無法通過作用于RyR或肌漿網(wǎng)膜上的鈣泵而發(fā)揮正性肌力作用。至于LZDO是否直接作用于RyR而發(fā)揮正性肌力作用，還有待于進一步研究。

人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)關(guān)于心臟安全評估的S7B文件中做出了明確的規(guī)定［14］，藥物心臟安全性評價分為必備實驗(在體清醒動物心電圖QTc和hERG實驗)及追加實驗(包括L型鈣電流、鈉電流、動作電位等)。對于藥物實驗的濃度及劑量也作出了明確的規(guī)定［15］，一般要求30倍臨床使用劑量?？紤]到LDZO無臨床劑量可參考，本實驗在體心電圖實驗采用LDZO的LD50的劑量，即1.7 g·kg－1，離體實驗采用 LZDO 發(fā)揮正性肌力作用的中間濃度的30倍，即300μmmol·L－1。本心臟安全性實驗表明，LZDO并未引起心律失常，也沒有抑制hNav1.5與hERG電流，表現(xiàn)出良好的心臟安全性。

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