知母總皂苷對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶行為和海馬突觸相關(guān)蛋白表達的影響

楊 成，金 英，李世章，隋海娟，金向楠

(遼寧醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)教研室，2.臨床醫(yī)學(xué)系，遼寧錦州 121001)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病 (Alzheimer disease，AD)患者早期即可出現(xiàn)突觸的喪失，其認知障礙程度與突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變密切相關(guān)。突觸的病理性重構(gòu)是作為AD認識障礙的重要病理基礎(chǔ)［1－3］。突觸素蛋白(synaptophysin，SYP)和富含脯氨酸的突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)是突觸核心構(gòu)建蛋白，在維持突觸正常功能和可塑性方面具有重要作用［4］。中藥知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥。知母總皂苷(saponins from A.aspholeloides Bge.，SAaB)是其有效成分。近年來研究［5］發(fā)現(xiàn)，SAaB能明顯改善脂多糖引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，抑制其海馬的炎癥反應(yīng)。SAaB通過調(diào)整腦內(nèi)毒蕈堿受體(muscarinic receptor，M)的密度和它的M1，M2受體亞型，使之調(diào)整到接近或達到正常，并且腦M受體的改善同學(xué)習(xí)記憶功能的改善呈正相關(guān)［6］。本實驗應(yīng)用自然衰老大鼠模型［7］進一步探討SAaB對海馬SYP和PSD95表達的影響及與磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白〔phosphorylated manmmalian target of sirolimus(Rapamycin)，p-mTOR〕信號通路的關(guān)系，為探討AD的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

SAaB，黃色粉末，UV法測純度＞80%〔用高效液相法測定主要成分:知母皂苷原B-Ⅱ(58%)，知母皂苷原E1(4%)和知母皂苷原B(1%)等〕，購自遼寧生物醫(yī)藥科技有限公司，用時以蒸餾水配制成所需濃度ig給藥;兔磷酸化mTOR抗體(Ser2448)、兔磷酸化Akt單克隆抗體(Ser473)、兔mTOR單克隆抗體和兔 Akt單克隆抗體購自 Cell Signaling Technology公司;鼠SYP單克隆抗體、兔PSD95多克隆抗體、山羊抗兔和山羊抗鼠IgG購自Santa Cruz公司;β肌動蛋白抗體購自Beyotime試劑公司。其他相關(guān)試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實驗室提供。

1.2 動物分組及給藥

18月齡 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量550～650 g;3月齡青年SD大鼠，♂，體質(zhì)量250～350 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007。

老年SD大鼠45只，隨機分成3組:老年對照組，SAaB 100和200 mg·kg－1組;另取3月齡青年SD大鼠15只設(shè)為青年大鼠對照組。SAaB用無菌蒸餾水溶解。ig給予SAaB，體積均為1.0 ml。青年對照組和老年對照組每天ig給予等量生理鹽水，連續(xù)用藥9周。

1.3 Morris水迷宮實驗

給藥第8周開始進行水迷宮實驗。水迷宮為直徑120 cm，高50 cm，水池水深 30 cm(高出平臺1 cm)，水溫控制在(22±2)℃，平臺置于第一象限，從4個象限等距的標記4個入水點，每只動物每天共訓(xùn)練4次。定向航行實驗時，每次采用不同的入水點，訓(xùn)練60 s，連續(xù)訓(xùn)練5 d。訓(xùn)練時將動物面朝池壁輕輕從入水點放入水中，同時啟動記錄裝置，記錄大鼠尋找平臺并爬上平臺所需的時間(逃避潛伏期)，如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，則將其放置于平臺上15 s，逃避潛伏期按60 s計算。第6天進行空間探索試驗，以檢測大鼠對平臺空間位置的記憶能力。空間探索試驗時撤除平臺，任選一個入水點將大鼠放入水中，記錄大鼠在60 s內(nèi)的游泳軌跡及游泳徑長等。實驗期間繼續(xù)給藥。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測SYP蛋白分布

Morris水迷宮實驗結(jié)束后，ip給予10%水合氯醛300 mg·kg－1麻醉大鼠，應(yīng)用腦立體定位儀在前囟(Bregma)-2.64及Bregma-4.08處進針進行標記后，經(jīng)頸總動脈持續(xù)灌注生理鹽水50 ml，然后再灌注4%多聚甲醛50 ml，取腦組織進行石蠟包埋，連續(xù)進行冠狀切片(厚度為5μm)，每4張取1張，進行免疫組織化學(xué)染色觀察海馬SYP蛋白表達分布的改變。免疫組織化學(xué)染色操作步驟按SABC免疫組化染色試劑盒操作說明進行。

1.5 Western印跡法檢測 CA3區(qū) SYP，PSD95，p-Akt和p-mTOR蛋白表達

應(yīng)用腦立體定位儀在Bregma-2.64及Bregma-4.08處進針進行標記后，取出腦組織，留取Bregma-2.64到Bregma-4.08之間的腦組織，進行連續(xù)冠狀切片(厚度為100μm)，在解剖顯微鏡下切取大鼠海馬CA3區(qū)［8］，立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中〔1%Triton，0.1%SDS，0.5%去氧膽酸，EDTA 1 mmol·L－1，Tris(pH 7.4)20 mmol·L－1，NaCl 150 mmol·L－1，NaF 10 mmol·L－1，苯甲基磺酰氟化物 (PMSF)0.1 mmol·L－1〕，4℃ 超聲粉碎后，12 000 × g 離心30 min，取上清液，用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，將各組蛋白濃度調(diào)成一致。用10% ～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，每個泳道蛋白上樣量為20μg。為了準確判斷目的蛋白帶的位置，一個泳道加SeeBlue Plus 2預(yù)染蛋白標記物，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用 TBS〔Tris(pH 8.0)10 mmol·L－1，NaCl 150 mmol·L－1〕洗膜3 次，每次10 min。將膜放入一抗中(一抗為1∶1000稀釋)，4℃過夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗(二抗為1∶1000稀釋)中，室溫孵育1～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min。將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進行化學(xué)發(fā)光。利用Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析。以每個條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與其相對應(yīng)的β肌動蛋白的比值表示蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SAaB對老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表1結(jié)果顯示，老年對照組大鼠出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)障礙，表現(xiàn)為逃避潛伏期較青年對照組明顯延長，在原平臺象限游泳時間占總游泳時間的百分比明顯降低(P＜0.05)。與老年對照組相比，SAaB 100和200 mg·kg－1組能明顯縮短老年大鼠的逃避潛伏期，增加大鼠在原平臺象限游泳時間占總時間的百分比(P ＜0.05)。

2.2 SAaB對老年大鼠海馬SYP蛋白表達的影響

2.2.1 免疫組化

青年對照組海馬CA1，CA3區(qū)及齒狀回均有SYP表達，SYP免疫陽性反應(yīng)呈細小點狀連接成片，顆粒染色深，密度大(圖1-A1，B1，C1)。老年對照組大鼠相應(yīng)腦區(qū)也均有SYP的表達，但呈顆粒狀或點狀，染色淺而稀疏(圖1-A2，B2，C2)。與老年對照組相比，給予 SAaB 100 和 200 mg·kg－1組后，SYP免疫陽性反應(yīng)為細小點狀連接成片，顆粒染色深，密度大(圖1-A3，A4，B3，B4，C3，C4)，以海馬 CA3區(qū)改變最為明顯(圖1-B3，B4)。

2.2.2 Western 印跡

與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬CA3區(qū)SYP蛋白表達水平明顯降低。與老年對照相比，給予SAaB 100和200 mg·kg－1的老年大鼠海馬CA3區(qū)SYP蛋白表達水平明顯增加(P＜0.01)，進一步說明SAaB能上調(diào)海馬CA3區(qū)SYP蛋白表達水平(圖2)。

Tab.1 Effect of saponins from Anemarrhena aspholeloides Bge.(SAaB)on the escape latencies and the percentage of the time spent in target quadrant of aged rats in Morris water maze test

Fig.1 Effect of SAaB on synaptophysin expression in rat hippocampus CA1(A)，CA3(B)and dentate gyrus(C).See Tab.1 for the treatment.1.young control;2.aged control;3.aged+SAaB 100 mg·kg－1;4.aged+SAaB 200 mg·kg－1 group.Arrows show the positive expression of synaptophysin.

Fig.2 Effect of SAaB on synaptophysin(SYP)levels in rat hippocampus CA3 region by Western blotting.See Tab.1 for the treatment.B was semiquantitative result of A.1.young control;2.aged control;3.aged+SAaB 100 mg·kg－1;4.aged+SAaB 200 mg·kg－1.±s，n=3.＊＊P ＜0.01，compared with young control group;##P ＜0.01，compared with aged control group.

2.3 SAaB對老年大鼠海馬CA3區(qū)PSD95蛋白表達的影響

如圖3所示，與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬CA3區(qū)PSD95蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01)。與老年對照組相比，給予 SAaB 100和200 mg·kg－1的老年大鼠海馬CA3區(qū)PSD95蛋白表達水平明顯增加(P＜0.01)。

Fig.3 Effect of SAaB on postsynaptic density protein 95 levels in rat hippocampus CA3 region.See Tab.1 for the treatment.B was semiquantitative result of A.1.young control;2.aged control;3.aged+SAaB 100 mg·kg－1;4.aged+SAaB 200 mg·kg－1.ˉx ± s，n=3.＊＊P ＜0.01，compared with theyoungcontrol group;##P ＜0.01，compared with the aged control group.

2.4 SAaB對大鼠海馬CA3區(qū)p-Akt表達的影響

如圖4所示，與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬CA3區(qū)p-Akt蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01)。與老年對照組相比，給予 SAaB 100和200 mg·kg－1的老年大鼠海馬 CA3區(qū) p-Akt蛋白表達水平明顯增加(P＜0.01)。

2.5 SAaB對老年大鼠海馬CA3區(qū)p-mTOR表達的影響

如圖5所示，與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬CA3區(qū)p-mTOR蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01)。與老年對照組相比，給予SAaB 100和200 mg·kg－1的老年大鼠海馬CA3區(qū)p-mTOR蛋白表達水平明顯增加(P＜0.01)。

Fig.4 Effect of SAaB on phosphorylated protein kinase B(p-Akt)protein levels in rat hippocampus CA3 region.See Tab.1 for the treatment.B was semiquantitative result of A.1.young control;2.aged control;3.aged+SAaB100 mg·kg－1;4.aged+SAaB 200 mg·kg－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with the young control group;##P ＜0.01，compared with the aged control group.

Fig.5 Effect of SAaB on phosphorylated mammalian target of sirolimus(Rapamycin)(p-mTOR)protein levels in rat hippocampus CA3 region.B was semiquantitative result of A.1.young control;2.aged control;3.aged+SAaB100 mg·kg－1;4.aged+SAaB 200 mg·kg－1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with the young control group;##P ＜0.01，compared with the aged control group.

3 討論

有不少研究報道，哺乳類動物衰老時腦內(nèi)突觸數(shù)量減少［9］，也有研究認為在衰老動物腦內(nèi)突觸數(shù)量沒有改變［10］。這種矛盾的結(jié)果除因研究方法和動物種類不同外，衰老變化的個體差異也是原因之一。本實驗依據(jù)一定的客觀標準對老年大鼠通過行為學(xué)表現(xiàn)進行篩選，避免將所有老年大鼠都作為同一整體來研究百造成對結(jié)果的干擾。本實驗采用自然衰老模型，Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，老年大鼠逃避潛伏期和原平臺象限游泳時間占總時間的明顯高于青年對照組，說明老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)障礙。

SYP是一種突觸前蛋白，屬突觸前終末的特異性標志物，其密度和分布可間接反映體內(nèi)突觸的數(shù)量和分布情況［11］。有研究表明，老年大鼠腦內(nèi)SYP明顯降低，且SYP丟失程度與記憶缺失程度成正相關(guān)［12］。過表達淀粉樣β前體蛋白和早老素的雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)SYP減少更明顯［13］。PSD95可以串集NMDA受體及其信號通路中的相關(guān)蛋白，組成受體-信號分子-調(diào)節(jié)分子-靶分子復(fù)合物，參與長時程突觸傳遞增強。最近研究表明，輕度認知功能損傷患者海馬PSD95水平明顯降低［14］。本實驗結(jié)果顯示，老年對照組PSD95表達較青年對照組明顯減少，提示突觸結(jié)構(gòu)和功能的異常與學(xué)習(xí)記憶能力下降密切相關(guān)。SAaB老年大鼠逃避潛伏期明顯縮短，平臺象限游泳時間占總時間的百分比增加，SYP和PSD95表達明顯增加。

mTOR可以整合生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和胰島素等所激發(fā)的信號通路，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個環(huán)節(jié)，借以調(diào)控細胞生長增殖和細胞周期［15］。Akt是其上游關(guān)鍵的信號物質(zhì)，可以通過活化 mTOR而上調(diào)PSD95表達水平［16］。新近的研究也顯示了AD患者腦區(qū)mTOR通路存在異常［17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，老年對照組大鼠 CA3區(qū)p-Akt，p-mTOR蛋白表達水平較青年對照組明顯降低，給予SAaB后則明顯增加，提示SAaB作用機制可能與激活A(yù)kt/mTOR信號通路，上調(diào)突觸相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。近來研究也表明，SAaB能增加增齡引起的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子［18］，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是Akt/mTOR信號通路的起始因子，可以激活該通路。mTOR通路的活化可上調(diào)PSD95等蛋白的表達，進而調(diào)節(jié)突觸的可塑性［19］。

總之，可能通過激活A(yù)kt/mTOR信號通路，影響突觸相關(guān)蛋白靶基因的表達，進而增加突觸前膜的突觸囊泡數(shù)目及增加突觸后膜致密物質(zhì)，最終增強了老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。但其調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白的機制復(fù)雜，還需要進一步的探索和研究。

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