局部注射Neuritin促進(jìn)骨折愈合的實驗研究

劉京敏，史晨輝，王維山，孫益明，彭方亮，張杰，董金波

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨一科，石河子832000）

Neuritin是以色列科學(xué)家Nedivi發(fā)現(xiàn)的可促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。研究顯示，Neuritin可以穩(wěn)定樹突棘上突觸的活性，促進(jìn)突觸成熟［1］。另外，Neuritin在血管領(lǐng)航和網(wǎng)絡(luò)形成中的軸突向?qū)ё饔茫?］，且作為一種新型血管生長因子在機(jī)體中起作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，在腦外傷合并骨折模型中，其血清中Neuritin的含量較正常大鼠及單純骨折的大鼠明顯升高。據(jù)此，我們推測Neuritin因子可能在腦外傷后骨折愈合加速過程中起著極其重要的作用。為了驗證Neuritin在骨折愈合中的重要作用，本實驗研究擬采用骨折斷端局部注射方法，觀察Neuritin在SD大鼠骨折模型中促進(jìn)骨折愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物實驗室完成，采用健康成年雄性S－D大鼠96只，體重（275±25）g，由新疆動物實驗中心提供。Neuritin重組蛋白購自美國sigma公司（生產(chǎn)日期：2011－01－03，批號：ab69775）?？逻_(dá)DR3500攝片機(jī)（柯達(dá)公司，日本）；佳能A80數(shù)碼照相機(jī)（佳能公司，日本）；Leica2135型石蠟切片機(jī) （萊卡，德國）；電鉆、直徑1 mm克氏針（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供）。

1.2 方法

1.2.1大鼠股骨骨折模型建立及試驗方法

將96只大鼠隨機(jī)分為對照組、實驗A、B、C組，每組24只。采用濃度為100 g／L的水合氯醛按照體重（300 mg／kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，無菌條件下取右側(cè)股骨外側(cè)切口，縱行切開約2 cm，顯露股骨中段，切斷前用游標(biāo)卡尺測量切斷處股骨直徑，截斷后選擇直徑為1 mm克氏針?biāo)枨粌?nèi)固定，術(shù)后應(yīng)用青霉素鈉肌注，連續(xù)7 d，分籠喂養(yǎng)允許自由活動。實驗A、B、C組于術(shù)后第3 d開始，在大鼠骨折斷端局部分別注射濃度為0.1、0.05、0.025μm／L的 Neuritin溶液0.3 m L，每日1次，連續(xù)注射7 d［11］；對照組于大鼠骨折斷端注射0.3 m L的生理鹽水。各組分別于術(shù)后1、2、4周分期采用頸椎脫臼法處死8只大鼠，并于骨折部位取材。

1.2.2大體觀察、骨痂體積測量、骨痂病理學(xué)檢測（HE染色）

動物處死前先行X線拍片觀察骨折愈合影像學(xué)觀察。處死后行取出骨折斷端的骨痂標(biāo)本，肉眼觀察其大體骨痂生長情況和骨折愈合情況，以骨痂Nords－letten X線評分標(biāo)準(zhǔn)評分，剔除骨痂周圍組織，采用Perkins骨痂體積測量公式：2πR1（R2－R1）L測量各組骨痂體積，其中R1表示股骨半徑，R2表示骨痂半徑，L表示骨痂長度。保留骨痂兩側(cè)各約1 cm骨組織截骨，常溫下4%的多聚甲醛固定24 h后，再用蒸餾水浸泡4 h，最后經(jīng)EDTA－2Na脫鈣4～6周。常規(guī)脫水石蠟包埋、切片。光鏡下觀察新生骨小梁、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨重塑等細(xì)胞組織學(xué)形態(tài)變化。以骨痂組織學(xué)評分方法評分。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體標(biāo)本觀察

觀察結(jié)果見表1。

由表1可知：1周時各組之間骨痂形成不明顯。2周時對照組斷端機(jī)化組織明顯增多，但是局部未見骨痂組織；B組、C組可見中大量肉芽組織生長，骨痂周徑增粗膨大，組間相差不大，但均少于A組。4周時對照組局部出現(xiàn)略小的梭型骨痂，部分纖維骨痂未完整連接。實驗A組骨痂觸之質(zhì)硬，見骨性骨痂形成，部分甚至已骨化。實驗B組、C組介于兩者之間。骨痂體積測量顯示，實驗各組明顯大于對照組（P＜0.05），在2、4周時實驗A組明顯大于其余各組（P＜0.05）。

表1 骨痂體積測量值及統(tǒng)計結(jié)果STab.1 Measurement and statistical results of callus volume

表1 骨痂體積測量值及統(tǒng)計結(jié)果STab.1 Measurement and statistical results of callus volume

注：△與實驗A組比較（P＜0.05），◇與實驗B組比較（P＜0.05），□與實驗C組比較（P＜0.05），○與對照組比較（P＜0.05）。

組別 時間／d 7 14 28對照組 2.06±0.05△ 10.06±0.12△◇□ 89.53±0.59△◇□實驗 A組 3.73±0.35○ 57.07±3.13◇□○166.28±3.82◇□○實驗B組 2.66±0.23 38.68±1.61△○ 130.52±1.19△□○實驗C組 2.17±0.07 18.32±1.04△○ 109.66±0.71△◇○

2.2 X線攝片觀察

結(jié)果如圖1所示。

圖1顯示：1周時對照組、實驗B組、C組骨折線清晰可見，斷端周圍未見明顯骨痂組織，實驗A組斷端亦可見骨折線，但有少量骨痂形成；2周時對照組骨折線仍然清楚，骨折斷端未見明顯的骨痂形成。實驗A組、B組、C組骨折線開始模糊，部分骨痂包繞在骨折斷端，但實驗A組最為明顯；4周時對照組骨折線開始模糊，有較少量骨痂形成，A組有大量骨痂生長，骨折線開始模糊甚至消失。

根據(jù)骨痂Nordsletten X線評分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。

圖1 術(shù)后各組各時間點X線片觀察Fig.1 X－ray observation at different time points after operation

表2 骨痂X線評分及統(tǒng)計結(jié)果STab.2 Grade and statistical results of callus X－ray

表2 骨痂X線評分及統(tǒng)計結(jié)果STab.2 Grade and statistical results of callus X－ray

注：△與實驗A組比較（P＜0.05），◇與實驗B組比較（P＜0.05），□與實驗C組比較（P＜0.05），○與對照組比較（P＜0.05）。

7 14 28對照組 0 0.86±0.64△◇□ 1.25±0.46組別 時間／d△◇□實驗 A組0.88±0.64◇□○2.25±0.71◇□○ 2.75±0.46◇□○實驗B組 0.62±0.74△○ 1.88±0.64△□○ 2.37±0.92△□○實驗C組 0.63±0.52△○ 1.62±0.52△◇○ 2.25±0.89△◇○

2.3 HE染色

結(jié)果見圖2。

由圖2可見：1周時對照組可見骨折端纖維母細(xì)胞自骨膜下長入骨折間隙，并夾雜少量成骨細(xì)胞；實驗A組成骨細(xì)胞數(shù)量較單純骨折組增多，骨折端見大量肉芽組織連接，并有纖維骨痂生成。2周時實驗各組骨折斷端軟骨性骨痂增多，實驗A組可見新生骨小梁長入。4周時對照組骨折端出現(xiàn)大量軟骨骨痂和骨性骨痂，但纖維母細(xì)胞減少，纖維性骨痂減少，實驗A組骨小梁形成骨性骨痂并連接斷端，骨折端為結(jié)構(gòu)均一的編織骨痂，成骨細(xì)胞活躍，骨膜增厚明顯。

軟骨細(xì)胞骨化評分結(jié)果見表3。

表3 軟骨細(xì)胞骨化評分及統(tǒng)計結(jié)果STab.3 Grade and statistical results of chondrocytes in ossification

表3 軟骨細(xì)胞骨化評分及統(tǒng)計結(jié)果STab.3 Grade and statistical results of chondrocytes in ossification

注：△與實驗A組比較（P＜0.05），◇與實驗B組比較（P＜0.05），□與實驗C組比較（P＜0.05），○與對照組比較（P＜0.05）。

組別 時間／d 7 14 28對照組 1.13±0.35△◇□1.75±0.71△◇□ 2.38±0.74△◇□實驗 A組2.13±0.64◇□○2.88±0.64◇□○ 3.75±0.46◇□○實驗B組 1.88±0.64△○ 2.38±0.52△□○ 3.13±0.64△□○實驗C組 1.50±0.53△○ 2.25±0.46△◇○ 2.88±0.64△◇○

圖2 術(shù)后各組個時間點組織學(xué)觀察（HE×40）Fig.2 Histological observation at different time points after operation（HE×40）

3 討論

臨床實踐發(fā)現(xiàn)，四肢骨則患者若同時合并有腦外傷，其骨折愈合速度明顯快于單純四肢骨折患者，骨痂過度生長，甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化。Boes等［4］證實合并腦外傷的大鼠股骨干骨折愈合時間明顯短于單純股骨干骨折者，其骨痂數(shù)量較對照組明顯增多。但是其具體機(jī)制尚不明確，如果能揭示這一現(xiàn)象的原因，將為臨床中骨不連、骨缺損等難治性骨創(chuàng)傷疾病的治療帶來希望。

大量研究證實在骨組織中有神經(jīng)纖維存在，有許多無髓和有髓神經(jīng)纖維支配骨膜、骨組織和骨髓［5］，在骨的愈合修復(fù)過程中伴隨有神經(jīng)纖維長人骨痂，在長骨骨不連斷端組織中幾乎沒有神經(jīng)纖維支配，這些說明骨痂中有無神經(jīng)纖維長人及神經(jīng)纖維的多少與骨折修復(fù)愈合的關(guān)系密切。因此，在骨折愈合過程中，神經(jīng)支配和調(diào)節(jié)起著重要作用，例如，腦外傷病人骨折愈合明顯加快，而骨折修復(fù)愈合過程中，局部骨生長因子或細(xì)胞因子起主要作用，包括有BMP、VEGF、PDGF、FGF、NGF等。彭吾訓(xùn)等［6］研究發(fā)現(xiàn)，雙相陶瓷生物骨（BCBB）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子 （basic fibroblast growth factor，b FGF）復(fù)合物具有較強(qiáng)的成骨能力。莫勇軍等［7］通過動物實驗觀察到，局部應(yīng)用NGF對大鼠骨折愈合有促進(jìn)作用，高濃度的NGF對骨折愈合有顯著促進(jìn)作用。而Neuritin作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一個新的成員，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞樹突和軸突的生長和分支，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元回路的形成，在神經(jīng)再生和可塑性中起著重要作用［8］。同時，Neuritin還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、粘附能力，促進(jìn)血管形成，并且，Neuritin在神經(jīng)損傷的修復(fù)過程中起著重要的作用［9］。魏勇等［10］研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷合并骨折病人血清中NGF、Neuritin表達(dá)明顯高于對照組，說明與骨折有密切的相關(guān)性，兩種因子可能在骨折愈合中共同起作用。我們前期研究已證實，在腦外傷合并骨折的大鼠模型，其血清中Neuritin含量明顯升高［11］，這說明，Neuritin與骨折愈合能力成正比，并呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性。據(jù)此，我們推測Neuritin可能是參與骨折愈合過程中一個重要的神經(jīng)因子。因此，本實驗我們通過在大鼠骨折斷端局部注射Neuritin發(fā)現(xiàn)，大鼠骨折愈合速度明顯加快，我們猜想這可能是Neuritin通過以下途徑實現(xiàn)：誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長入；增加了骨折斷端血液供應(yīng)；定位于胞漿中［12］與多種神經(jīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子協(xié)同作用及調(diào)節(jié)相關(guān)基因促進(jìn)骨折愈合等。

本實驗同時還采用不同濃度梯度的Neuritin對SD大鼠骨折端進(jìn)行干預(yù)，通過大體觀察及影像學(xué)檢查結(jié)果顯示，術(shù)后1周空白對照組無骨痂形成，隨著時間的延長，逐漸出現(xiàn)少量骨痂。同時實驗各組隨時間延長，亦出現(xiàn)骨痂快速增多，骨折線逐漸模糊，甚至部分已骨化，在同一時間點上實驗各組變化均比對照組明顯，實驗組之間比較A組變化更加顯著，B組、C組次之，這表明A組在加速骨痂形成及新生骨痂成熟方面效果顯著。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，對照組在1周時軟骨細(xì)胞骨化極少，隨著時間的延長，逐漸出現(xiàn)少量骨化組織，而實驗組從1周到4周，軟骨細(xì)胞明顯增多，軟骨化骨的比率逐漸增高，而且實驗各組均比對照組變化明顯；在同一時間點上，實驗各組之間比較A組較B組、C組變化更加顯著，這表明A組在促進(jìn)骨痂形成、成熟及加速骨折愈合方面明顯優(yōu)于其他組。上述各項檢測指標(biāo)均顯示，在適宜的濃度范圍內(nèi)，Neuritin濃度越高，其促進(jìn)骨折愈合越能達(dá)到最佳效果，即在加速骨痂形成及新生骨痂成熟方面效果顯著。

綜上所述，局部應(yīng)用Neuritin對大鼠骨折愈合有促進(jìn)作用，低濃度梯度的Neuritin促進(jìn)作用不明顯，高濃度梯度的Neuritin有明顯促進(jìn)作用，但是由于Neuritin在體內(nèi)的含量目前仍缺乏實驗證據(jù)，在選擇Neuritin劑量時也沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致本實驗選擇Neuritin的濃度梯度有一定局限性，尚未確定促進(jìn)大鼠骨折愈合的最佳有效濃度，本研究意在通過動物實驗，初步驗證Neuritin的作用，以及是否存在劑量相關(guān)性；因此，是否有更佳的有效治療濃度，仍有待進(jìn)一步研究。

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