正交實驗法優(yōu)選管花肉蓯蓉酒浸炮制工藝的研究

劉雯霞，譚勇，李盈，王恒，王翔飛

（石河子大學藥學院／新疆特種植物藥資源重點實驗室，石河子832002）

管 花 肉 蓯 蓉 （Citanche tubulosa（Schenk）Wight.）為列當科肉蓯蓉屬多年生寄生植物的干燥帶鱗葉的肉質莖，咸而溫，具有補腎陽、益精血、潤腸通便和延緩衰老等功能［1］。管花肉從蓉目前是肉從蓉的主要基源植物，主產于新疆南部即天山以南塔克拉瑪干沙漠周圍，是目前產量最大，用量最多的肉蓯蓉品種［2］。宋代始載肉蓯蓉有“凡使清酒浸一宿，此偏隔人心前氣不散，令人上氣不出”，對其炮制化學，炮制質量以及炮制工藝都有一定的研究。2010版藥典中管花肉蓯蓉只收載了生切片炮制品，本研究為進一步豐富新疆管花肉蓯蓉的藥用形式提供一定的實驗支撐。

管花肉蓯蓉化學成分，目前就已分離40多個化合物，其中以苯乙醇苷化合物為主要有效成分，據報道松果菊苷對抗衰老和增強記憶具有顯著療效［3－4］。酒浸法的選擇是針對新疆管花肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分的結構和極性特點，由于臨床應用多水煎，酒浸后能增加苯乙醇苷類成分的提取率，同時酒制能夠增強補腎助陽類中藥的作用，從而提高臨床藥效。采用正交優(yōu)選和高效液相色譜相結合的方法，對能夠影響管花肉蓯蓉的炮制的因素如飲片規(guī)格，酒的種類，酒潤時間進行優(yōu)化，探討該工藝對管花肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分松果菊苷含量的影響，從而驗證新疆管花肉蓯蓉酒浸法炮制工藝的科學性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器

HPLC島津LC－20AT高效液相色譜儀（日本導津公司）；CBM－10A 型色譜工作站；SPD－10A型紫外檢測器（日本導津公司）；PLATISILTM ODS（5μL，4.6×250 mm）色譜柱；萬分之一天平（賽多利斯）；超聲提取儀（濟寧天華）。

1.1.2樣品與試劑

管花肉蓯蓉藥材購自和田天力沙生藥物開發(fā)有限責任公司，經石河子大學藥學院中藥系副教授譚勇鑒定為管花肉蓯蓉（Citanche tubulosa（Schenk）Wight.）的干燥帶鱗葉的肉質莖；松果菊苷標準品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號111670－200503）；乙腈和甲醇（色譜純，江陰精細化工研究所），蒸餾水（三蒸），冰醋酸（分析純，南京化學工業(yè)公司）；白酒（酒精度數50°，塔城市劍城春酒業(yè)有限責任公司），黃酒（酒精度數20°，紹興糯米老酒），米酒（酒精度數10°，廣東鶴山市桃源躍馬酒廠）。

1.2 方法

1.2.1正交實驗

取凈制的新疆肉蓯蓉切片，厚度2、4、6 mm的飲片各50 g。取加工切制不同規(guī)格的肉蓯蓉各10 g，干燥后按表1設計的因素水平進行正交實驗，其中藥料比為100∶30。炮制品采用60℃溫度烘干，中途翻動1～2次，取出后放涼研成粉末備用（表1）。

表1 因素水平表Tab.1 Factor and level

1.2.2松果菊苷含量測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：PLATISILTMODS（5μL，4.6×250 mm）；流動相：甲醇－乙腈－1%醋酸溶液 （15∶10∶75）；流速0.80 m L／min。檢測器參數：檢測波長：334 nm；柱溫：30℃。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取在60℃真空干燥至恒重的松果菊苷對照品2.0 mg，置10 m L容量瓶中，加60%甲醇溶解并定容，即得0.20 mg／m L對照品儲備液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 管花肉蓯蓉各炮制品分別粉碎過6號篩，干燥至恒重，分別精密稱取藥材粉末0.5 g置于錐形瓶中，加50%甲醇25 m L，稱定重量，浸潤30 min，超聲提取40 min，放冷，稱定重量，加50%甲醇補足重量，搖勻，0.22μm濾膜濾過。以峰面積計算松果菊苷含量。

1.2.2.4 標準曲線的制備 將松果菊苷對照品貯備液稀釋至0.02 mg／m L，精密吸取2.5、5、7.5、10、12.5、15μL進樣，按上述色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標，制作標準曲線，得到回歸方程Y＝465494 X －64289，R2＝0.9999，線性范圍0.05～0.3μg，結果表明在此范圍內存在良好的線性關系。

1.2.2.5 精密度實驗 精密吸取松果菊苷對照品溶液，按照上述色譜條件，重復進樣，測得峰面積，計算RSD為1.75%（n＝6）。

1.2.2.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一濃度的樣品溶液，按照上述色譜條件，在24小時內每隔4 h測定一次，記錄峰面積，結果顯示松果菊苷峰面積的RSD＝1.75%（n＝6）。

1.2.2.7 重復性實驗 精密稱取管花肉蓯蓉生品粉末1.0 g，平行6份，按“1.2.2.3”制備供試品溶液，以外標法計算松果菊苷的含量（%），計算測定結果的RSD為2.78%（n＝6）。

1.2.2.8 加樣回收率實驗 取已知含量的管花肉蓯蓉藥材粉末1.0 g，平行6份，分別精密加入松果菊苷對照品，按"1.2.2.3"制備供試品溶液，計算加樣回收率，結果見表2，松果菊苷平均回收率為97.5%。

表2 加樣回收率試驗結果 n＝6Tab.2 Recovery test

2 結果與分析

2.1 樣品的含量測定及結果分析

按照“1.2.2.3”項下方法和“1.2.2.1”項下的測定條件，對各酒浸樣品進行含量測定，結果及分析見圖1、圖2及表3、表4。

圖1 松果菊苷對照品Fig.1 Echinacoside

圖2 管花肉蓯蓉生品Fig.2 Citanche tubulosa （ Schenk）wigh

表3 管花肉蓯蓉松果菊苷含量正交試驗結果Tab.3 Orthogonal Experiment Result of Citanche tubulosa（Schenk）Wight

表4 方差分析表Tab.4 Variance analysis

注：F0.01（2，2）＝99.0，F0.05（2，2）＝19.0。

直觀分析結果表明，三因素中B因素即酒的種類對實驗結果影響最大，為管花肉蓯蓉酒浸工藝的主要影響因素，酒潤時間C為次要因素，各因素對管花肉蓯蓉松果菊苷含量的影響結果依次為B＞C＞A。進一步的方差分析說明（結果見表4），只有因素C對管花肉蓯蓉松果菊苷的含量有顯著性的影響，綜合分析，在管花肉蓯蓉酒炒炮制工藝中，最佳工藝條件為A1B3C3，即飲片規(guī)格厚度為6 mm的凈藥米酒浸制120 min。

2.2 驗證實驗

為確證該工藝的穩(wěn)定性，在上述正交實驗的基礎上，按篩選的最佳工藝條件，進行了重復驗證實驗。稱取凈制的管花肉蓯蓉20 g，按照以上最優(yōu)工藝參數進行3次實驗，結果松果菊苷平均含量為1.97%（RSD＝1.80%），表明優(yōu)選工藝切實可行。

2.3 水煎液中松果菊苷含量測定

中藥飲片多為水煎使用，故實驗對水煎液中松果菊苷含量測定，進一步印證該方法的可行性。取“2.2”項下樣品，分別精密稱取各粗粉2.0 g，加水20.0 m L，稱重，混勻，煎煮60 min，放置過夜，稱重，加水補足重量，濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液10.0 m L，續(xù)濾液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗滌，定容于2 m L量瓶中，以峰面積計算松果菊苷含量。結果見表5。

表5 生品與炮制品管花肉蓯蓉水煎液松果菊苷含量比較Tab.5 Comparison of the echinacoside contents between the raw and treated Citanche tubulosa（Schenk）

結果表明新疆管花肉蓯蓉水煎液中松果菊苷含量低于醇提液，同時生品和炮制品水煎液的松果菊苷含量比較，炮制品較生品有一定的提高，可見該炮制方法對于臨床飲片使用有一定的意義。

3 討論與結論

現代研究中陳妙華形成了加黃酒常壓燉的方法最佳［5］。炮制質量研究，采用高效液相色譜法對肉蓯蓉生品及不同炮制品中麥角甾苷的含量進行比較研究。結果表明炮制是麥角甾苷的含量降低，高壓處理則降低更多［6］。本研究對酒浸工藝進行實驗研究，結果表明，輔料酒對松果菊苷含量影響有一定的差別，其中白酒浸后含量最低平均含量為1.43%，其次為黃酒浸含量為1.502%，含量最高的為米酒平均含量為1.732%。本工藝比傳統(tǒng)輔料黃酒或白酒含量略高，其機理還有待于進一步深入研究。

已有研究報道［7－8］，選用334 nm 檢測松果菊苷的波長，以甲醇－乙腈－1%醋酸溶液（15∶10∶75）為流動相。本試驗通過紫外掃描，確定在334nm有明顯吸收峰，流動相以甲醇－乙腈－1%醋酸溶液（15∶10∶75）為流動相，考慮到高濃度酸對色譜柱損壞較嚴重，故減低其比例，發(fā)現不同程度的出現了拖尾現象，故仍選擇甲醇－乙腈－1%醋酸溶液（15∶10∶75）為流動相。對超聲和回流兩種提取方法進行考察，發(fā)現超聲提取有效成分提取率高，并且操作簡便快捷。提取溶劑選擇分別設置了純甲醇，90%甲醇，70%甲醇，50%甲醇和30%甲醇，結果50%甲醇提取率更高，故定位50%作為提取溶劑。提取時間考察考慮到松果菊苷的不穩(wěn)定性，長時間超聲提取會提高水溫，因此一定程度上會影響到松果菊苷的含量，因此時間分別考察了20 min，30 min，40 min和60 min，結果表明最佳提取時間是40 min。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.2010年版一部.北京：化學工業(yè)出版社，2010：126.

［2］陳敏，肖蘇萍，崔光紅，等.管花肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量測定［J］.中國中藥雜志，2005，30（11）：839－841.

［3］雷麗，宋志宏，屠鵬飛，等.肉蓯蓉屬植物的化學成分研究進展［J］.中草藥，2003，34（5）：473.

［4］吳波，付玉梅.肉蓯蓉多糖對衰老小鼠脂質過氧化的影響［J］.廣州醫(yī)學院學報，2004，32（4）：27－28.

［5］陳妙華.肉蓯蓉最佳炮制方法的篩選［J］.中藥材，1996，19（10）：508.

［6］張思巨.肉蓯蓉生品及不同炮制品麥角甾苷含量比較研究［J］.中國藥學雜志，1996，31（6）：335.

［7］張思巨，劉麗，于江永，等.HPLC法測定肉蓯蓉藥材中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量［J］.中國藥學雜志，2004，39（10）：741－742.

［8］李鑫，堵年生.RP－HPLC法測定不同寄主和不同產地肉蓯蓉中松果菊苷和麥角甾苷的含量［J］.藥物分析雜志，2003，23（4）：254－255.