電除顫術(shù)后竇房結(jié)縫隙連接蛋白40的表達(dá)

張燕翔 (武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，湖北 武漢 430071；長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，湖北 荊州 434023)

孟祥志，汪 浩，王 春 (武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，湖北 武漢 430071)

電除顫術(shù)后竇房結(jié)縫隙連接蛋白40的表達(dá)

張燕翔 (武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，湖北 武漢 430071；長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，湖北 荊州 434023)

孟祥志，汪 浩，王 春 (武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，湖北 武漢 430071)

目的：探討人工心肺復(fù)蘇電除顫術(shù)后縫隙連接蛋白40(Connexin40, Cx40)在竇房結(jié)(SAN)中的表達(dá)。方法：從2008年至2010年成人尸體解剖案例中，篩選出20例，將其中心肺復(fù)蘇過程中接受過電除顫者設(shè)為A組(n=7)；僅施行標(biāo)準(zhǔn)人工心肺復(fù)蘇術(shù)而未接受電除顫者設(shè)為B組(n=8)；另選取5例正常竇房結(jié)組織設(shè)為對照組(C組,n=5)。竇房結(jié)取材，常規(guī)制片，分別行MASSON染色及免疫組化Cx40染色，用圖像分析系統(tǒng)分析每高倍視野竇房結(jié)間質(zhì)比例及竇房結(jié)中Cx40表達(dá)的IOD值， 統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果：A組竇房結(jié)間質(zhì)比例與B組比較、A組與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；B組與C組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；A組SAN中 Cx40表達(dá)IOD值與B組比較、A組與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；B組與C組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。結(jié)論：電除顫術(shù)后SAN間質(zhì)膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散，部分?jǐn)嗔眩[，SAN的自我保護(hù)功能部分受損；SAN中Cx40表達(dá)降低，GJ通道功能受損。

縫隙連接蛋白40；竇房結(jié)；法醫(yī)病理學(xué)；心肺復(fù)蘇；電除顫術(shù)

人工心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation，CPR)和電除顫術(shù)(electrical defibrillation，ED)廣泛應(yīng)用于臨床急救，然而，在施行過程中亦可對人體造成多種損傷。法醫(yī)實(shí)踐中，常見肋骨骨折、胸骨骨折等。近年文獻(xiàn)中，CPR及ED對心臟的損傷研究大多局限于心肌[1-2]，而一定強(qiáng)度電流造成心傳導(dǎo)系統(tǒng)損傷的報(bào)道則見于電擊死的研究中[3]。CPR和電除顫術(shù)造成人體傳導(dǎo)系統(tǒng)損傷少見報(bào)道[4-5]。竇房結(jié)(sinoatrial node, SAN)是傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，在心電產(chǎn)生和傳導(dǎo)方面起作用。其心電的產(chǎn)生和傳導(dǎo)需要依賴功能細(xì)胞之間的電偶聯(lián)來實(shí)現(xiàn)，縫隙連接通道(Gap junction, GJ)是實(shí)現(xiàn)功能細(xì)胞間電偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[6-7]。我們通過觀察人體接受CPR及ED術(shù)后SAN組織細(xì)胞形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)的變化，并通過SAN縫隙連接蛋白40(Connexin40，Cx40)的表達(dá)差異，初步探討CPR及ED對人體SAN功能的影響。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

多克隆兔抗人connexin 40 Ⅰ抗(北京中杉公司)，PV9000免疫組化試劑盒(福州邁新公司)，MASSON三色染色試劑盒(珠海貝索公司)，顯微照相系統(tǒng)(Leica LB-2型，德國)，Image-pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics, USA)。

1.2方法

1.2.1分組 本組資料來源于2008年至2010年武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)司法鑒定所成人尸體解剖133案例，篩選出其中20例，均符合如下標(biāo)準(zhǔn)：①檔案完整，資料齊全，保存有全部的治療搶救記錄。②均于死后24h內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)尸體解剖，后經(jīng)法醫(yī)病理學(xué)診斷死因明確。③死亡前均無心傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病及損傷史，亦無胸部外傷史。④死亡前均接受過心肺復(fù)蘇。將其中7例心肺復(fù)蘇過程中接受過電除顫者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組(A組)；僅施行心肺復(fù)蘇術(shù)而未接受電除顫者8例設(shè)為B組；選取5例未接受過心肺復(fù)蘇搶救，經(jīng)法醫(yī)病理學(xué)檢查證實(shí)生前無心臟及傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病者設(shè)為對照組(C組)。

1.2.2取材、制片及染色 采用宋一璇[8]改良的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)解剖法，獲取死者心臟竇房結(jié)樣本，10%中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(4～6μm)分別作HE染色、MASSON三色特殊染色、免疫組織化學(xué)染色。MASSON三色特殊染色前切片脫蠟至水，后浸入Bouin氏固定液37°溫箱處理2h，水洗后再行染色，具體步驟參照試劑盒附帶說明書，甲苯胺藍(lán)復(fù)染，中性樹膠封固；免疫組織化學(xué)具體步驟參照說明書，每例均以PBS液代替Cx40一抗作為陰性對照，以試劑盒附送的陽性片作為陽性對照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

1.2.3圖像分析 MASSON三色特殊染色切片利用Image-pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)，高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400)，統(tǒng)計(jì)每高倍視野竇房結(jié)間質(zhì)所占比例，每高倍視野竇房結(jié)間質(zhì)比例(%)=(每高倍視野竇房結(jié)間質(zhì)面積/每高倍視野竇房結(jié)組織面積)×100%。

免疫組化切片均隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在高倍視野下(×400)利用Image-pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)，進(jìn)行各組竇房結(jié)Cx40表達(dá)的半定量分析，測定積分光密度值 (Integrated Optical Density，IOD)，比較Cx40含量變化情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1一般形態(tài)觀察結(jié)果

人SAN鏡下HE染色較淡，能明顯與周圍心房肌區(qū)別開。A組起搏細(xì)胞(P細(xì)胞)邊界不清，腫脹明顯，胞核染色加深或核內(nèi)空亮，染色質(zhì)邊集，胞漿嗜堿性，部分P細(xì)胞見散在的細(xì)胞核固縮，移形細(xì)胞(T細(xì)胞)亦腫脹，橫紋模糊，辨識不清，局部可見零星立方形T細(xì)胞，SAN間質(zhì)疏松化，間質(zhì)水腫，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血，但各例肉眼及鏡下均未見出血。B組與C組鏡下變化差異并不明顯，P細(xì)胞、T細(xì)胞顯露清楚，P細(xì)胞小而短，橫切呈短棒狀或卵圓形，胞質(zhì)淡染，間質(zhì)亦有輕度水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；T細(xì)胞大多位于周邊區(qū)，體積比P細(xì)胞大，細(xì)胞形態(tài)狹長，核呈長梭形。3組鏡下SAN實(shí)質(zhì)間質(zhì)成分相互混雜，界限不清，HE染色下無法清晰比較P細(xì)胞、T細(xì)胞及結(jié)締組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞數(shù)目的變化。

2.2MASSON染色結(jié)果

SAN采用Mssson三色染色結(jié)果細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，實(shí)質(zhì)間質(zhì)辨析清楚，P細(xì)胞、T細(xì)胞和結(jié)締組織區(qū)別明顯，肌纖維橫紋顯示良好。A組膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)局部連續(xù)性中斷，毛細(xì)血管擴(kuò)張，未見出血改變(見圖1)。竇房結(jié)間質(zhì)比例較B組、C組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，B組與C組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)(見表1)。

(a) A組竇房結(jié)間質(zhì)膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)局部連續(xù)性中斷，毛細(xì)血管擴(kuò)張；(b)實(shí)質(zhì)間質(zhì)辨析清楚，P細(xì)胞、T細(xì)胞和結(jié)締組織區(qū)別明顯，肌纖維橫紋顯示良好；(c)正常對照組。

2.3免疫組化Cx40表達(dá)結(jié)果

表1 各組竇房結(jié)高倍鏡下間質(zhì)比例和Cx40表達(dá)IOD值比較

尸檢所得人體心臟SAN 中棕黃色Cx40免疫陽性顆粒呈團(tuán)塊狀聚集, 分布不均，細(xì)胞膜上或彌散入胞漿表達(dá),多聚集于細(xì)胞的側(cè)側(cè)或端端連接處, Cx40在心肌的表達(dá)較SAN內(nèi)多。在SAN內(nèi)，Cx40在P細(xì)胞、T細(xì)胞表達(dá)稀疏，多分布于中心區(qū)結(jié)動脈周圍，SAN周邊部分布極少，但在SAN的傳導(dǎo)纖維內(nèi)表達(dá)明顯(見圖2)。A組SAN Cx40表達(dá)IOD值較B組、C組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，B組與C組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)(見表1)。

(a) Cx40 免疫陽性顆粒呈團(tuán)塊狀聚集, 分布不均，細(xì)胞膜上或彌散入胞漿表達(dá),多聚集于細(xì)胞的側(cè)側(cè)或端端連接處,A組表達(dá)降低；(b)B組Cx40竇房結(jié)中陽性表達(dá)與C組差異并不顯著；(c)正常對照組。

3 討 論

當(dāng)心搏驟停發(fā)生時(shí)，迅速而有效的采取CPR，能提高搶救的成功率，心搏驟?；颊叽蠹s有80%～90%第一個(gè)捕獲的心電圖是室顫, 因而盡早實(shí)施ED是治療室顫的有效手段,除顫越早, 成功率越高[9-10]。除顫器產(chǎn)生強(qiáng)度可控的脈沖電流作用于心臟, 瞬間電流強(qiáng)度可達(dá)360J或者更高，強(qiáng)迫所有心肌細(xì)胞在瞬間幾乎全部處于除極狀態(tài)，造成瞬間停搏，這樣就有可能讓自律性最高的竇房結(jié)重新起搏心臟，控制心搏轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律[11]。但在搶救患者生命的同時(shí)，可能產(chǎn)生有害效應(yīng)，包括細(xì)胞膜斷裂、電擊后阻滯、機(jī)械性功能不良和新的快速心律失常[12]。

在法醫(yī)實(shí)踐中，電擊死者SAN的組織病理學(xué)觀察其形態(tài)變化包括點(diǎn)、片狀出血，P細(xì)胞、T細(xì)胞濁腫、傳導(dǎo)纖維濁腫，嚴(yán)重時(shí)甚至可見液化性壞死等表現(xiàn)[13]。我們觀察常規(guī)HE染色鏡下A組表現(xiàn)與其大致相符，但均未見心內(nèi)膜下出血及液化性壞死等現(xiàn)象，B組和C組鏡下觀察無異常；提示在施行電除顫術(shù)后，可能造成竇房結(jié)損傷。而鏡下未能觀察到如電擊死者所具有的心內(nèi)膜下出血及液化性壞死等現(xiàn)象的原因，考慮為醫(yī)用除顫器電流強(qiáng)度雖然瞬間可達(dá)到360焦耳甚至更高，但刺激時(shí)間較短，其傷害程度較電擊輕。

在心傳導(dǎo)系統(tǒng)以及SAN的研究中，間質(zhì)變化特點(diǎn)一直是不容忽視的要點(diǎn)之一。MASSON三色染色法能夠清晰顯示SAN膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)支架，使得主質(zhì)與間質(zhì)對比清楚；同時(shí)，MASSON三色染色法能更好將SAN中P與T細(xì)胞區(qū)別開，使功能心肌細(xì)胞橫紋顯示更加清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在光學(xué)顯微鏡下觀察人體SAN形態(tài)，MASSON染色顯然較傳統(tǒng)的HE染色更加適合。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，A組SAN間質(zhì)比例較B組、C組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)，B組與C組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。這一結(jié)果說明，心電除顫電流刺激可造成SAN間質(zhì)膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散，局部斷裂，間質(zhì)水腫， SAN的自我保護(hù)功能部分受損；而B組以單純的胸外心臟按壓，雖然亦可觀察到SAN間質(zhì)水腫和毛細(xì)血管的擴(kuò)張，但其程度明顯較A組為輕。

GJ是相鄰心肌細(xì)胞膜之間形成的特化區(qū)域，在細(xì)胞間起代謝耦聯(lián)和電耦聯(lián)作用,完成細(xì)胞之間的電化學(xué)信息交換，是維持電生理搏動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。GJ由相鄰心肌細(xì)胞胞膜上的縫隙連接蛋白半通道(connexin hemichannels)對接形成連接小體，每個(gè)半通道則由6個(gè)縫隙連接蛋白(Connexin, Cx)構(gòu)成[7]，其通道功能主要受到細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、pH值變化以及神經(jīng)激素的調(diào)節(jié)[14-15]。Kwong等[16]通過對成年犬的研究發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)中大約有55%細(xì)胞只表達(dá)Cx40，宋慧芳等[7]針對人體竇房結(jié)的實(shí)驗(yàn)研究也證明，人體竇房結(jié)中縫隙連接蛋白的表達(dá)以Cx40為主，其他類型的連接蛋白分布稀少。亦有研究表明，Cx40的表達(dá)異常與各種類型的心律失常特別是房顫的持續(xù)存在密切相關(guān)[17-19]。以上結(jié)論說明，SAN電沖動的產(chǎn)生、傳導(dǎo)以及心律的維持與Cx40密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，SAN 中棕黃色Cx40 免疫陽性顆粒呈團(tuán)塊狀聚集,中心區(qū)結(jié)動脈周圍分布相對較多，而SAN周邊部分布少，可能與SAN中心區(qū)P細(xì)胞產(chǎn)生的心電沖動集中整合，保證結(jié)優(yōu)勢起搏點(diǎn)能夠集聚充分的起搏沖動后傳導(dǎo)有關(guān)；Cx40在心肌的表達(dá)較SAN內(nèi)表達(dá)多，說明心電沖動在SAN內(nèi)傳導(dǎo)可能較慢，符合SAN能自動發(fā)出興奮但不能很快傳導(dǎo)的電生理特性。本實(shí)驗(yàn)A組SAN中 Cx40表達(dá)IOD值較B組、C組明顯降低，其IOD值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。Cx40在電除顫組中的表達(dá)明顯減少的可能機(jī)制是：心臟遭受除顫電流刺激后，間質(zhì)膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散，部分?jǐn)嗔?，SAN的自我保護(hù)與興奮傳導(dǎo)隔離功能部分受損；同時(shí)除顫電流刺激強(qiáng)迫所有心肌細(xì)胞在瞬間幾乎全部處于除極狀態(tài)，部分受損SAN細(xì)胞細(xì)胞膜斷裂，GJ通道損傷，電流刺激使通道蛋白活性喪失；此外，電流刺激亦可使細(xì)胞膜上的鈉鉀泵、鈣泵運(yùn)轉(zhuǎn)失靈，局部離子濃度發(fā)生變化，進(jìn)一步影響GJ通道的正常功能；而B組與C組Cx40表達(dá)差異并不顯著，說明對心肌單純的機(jī)械刺激并未造成通道蛋白的活性喪失。

綜上所述，對人體施行人工心肺復(fù)蘇和電除顫術(shù)后SAN間質(zhì)膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散，部分?jǐn)嗔?，水腫，SAN的自我保護(hù)功能部分受損；SAN中Cx40表達(dá)降低，GJ通道蛋白活性部分喪失。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.01.002

R361

A

1673-1409(2012)01-R004-04

2011 11 27

張燕翔(1975)，男，湖北荊州人，實(shí)驗(yàn)師，碩士生，主要從事心血管病理與猝死研究；通訊作者：孟祥志，EMAil：mxz63@hotmAil.Com。