Calpain抑制劑ALLN對(duì)酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)脊髓背角環(huán)氧化酶-2表達(dá)水平的影響

王靜捷，陳廣俊，陳 雯，杜 金，羅愛(ài)倫，黃宇光

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京100730

2江蘇省蘇北人民醫(yī)院麻醉科，江蘇揚(yáng)州225001

Calpain是一類(lèi)鈣離子依賴半胱氨酸蛋白酶，參與許多生理和病理過(guò)程，包括神經(jīng)塑形［1］和神經(jīng)細(xì)胞死亡［2］。外周組織炎性損傷后會(huì)引起脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，進(jìn)而可能引起calpain活化?；罨蟮腸alpain通過(guò)其限制性蛋白水解作用參與細(xì)胞內(nèi)許多受鈣離子調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，改變這些特異性底物蛋白的功能或促進(jìn)其降解。有研究表明，傷害性神經(jīng)元敏化過(guò)程中calpain被活化［3］。本研究旨在采用酵母多糖足底炎性疼痛大鼠模型，評(píng)價(jià)模型大鼠的疼痛行為學(xué)、炎性水腫程度以及脊髓背角calpain的活化情況;并通過(guò)calpain抑制劑ALLN干預(yù)模型大鼠，觀察其鎮(zhèn)痛作用和對(duì)脊髓背角環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達(dá)的影響，探討calpain在炎性疼痛中的作用機(jī)制。

材料和方法

動(dòng)物及分組處理

疼痛模型的建立:SD大鼠48只，6周齡，雄性，體重160～200 g。隨機(jī)分為3組:對(duì)照組 (n=8)、假手術(shù)組 (n=16，其中8只于制模后4 h處死取腰段脊髓背角組織，余下8只進(jìn)行疼痛行為學(xué)測(cè)定及左側(cè)后足最大厚度測(cè)量)和酵母多糖組 (n=24，分別于制模后4、24、48 h進(jìn)行疼痛行為學(xué)測(cè)定及左側(cè)后足最大厚度測(cè)量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量結(jié)束后處死8只)。按Meller等［4］方法，通過(guò)在大鼠左側(cè)后足足底皮下注射酵母多糖1.25 mg制作酵母多糖足底炎性疼痛模型。假手術(shù)組大鼠在左側(cè)后足足底皮下注射同等容積的PBS。各組大鼠在制模前及制模結(jié)束后0.5、1、2、4、8、24、48 h進(jìn)行機(jī)械刺激縮足閾值 (mechanical withdrawal threshold，MWT)和左側(cè)后足足底最大厚度測(cè)量。并于上述相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死取腰段脊髓背角進(jìn)行Western印跡分析，測(cè)定calpain活化水平。

ALLN干預(yù)實(shí)驗(yàn):SD大鼠64只，6周齡，雄性，體重160～200 g，隨機(jī)分為3組。假手術(shù)組 (n=16):足底注射PBS 100 μl。其中8只于假手術(shù)前、假手術(shù)后0.5、1、2、4、8、24、48 h測(cè)定MWT和左側(cè)后足足底最大厚度;余下8只于假手術(shù)后4 h處死。二甲基亞砜 (dimethyl sulphoxide，DMSO)溶劑對(duì)照組 (Z+V組，n=24):腹腔注射2 ml/kg的溶劑DMSO(與Z+A組注射ALLN 20mg/kg所需DMSO的體積相同)，30 min后足底注射酵母多糖 1.25 mg制模。于制模前、制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h測(cè)定MWT和左側(cè)后足最大厚度，并分別于制模后4、24、48 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只。ALLN治療組(Z+A組，n=24):腹腔注射劑量為20 mg/kg的ALLN注射液，30 min后足底注射酵母多糖1.25 mg制模。于制模前、制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h測(cè)定MWT和左側(cè)后足最大厚度，并分別于制模后4、24、48 h處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死8只。各組于上述相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死的大鼠均取腰段脊髓背角進(jìn)行Western印跡分析，測(cè)定COX-2表達(dá)水平。

酵母多糖及ALLN注射液配制1.25 mg酵母多糖 (Sigma)溶解于100 μl PBS中，配制酵母多糖注射液。10 mg ALLN(Calbiochem)溶解于1 ml的有機(jī)溶液DMSO中，配制ALLN注射液，使其濃度為10 μg/μl， -20℃ 保存。

MWT測(cè)定在安靜的環(huán)境，將大鼠放在金屬絲網(wǎng)眼墊上，用透明塑料鼠籠約束大鼠，適應(yīng)15 min后，采用電子von Fray壓力測(cè)痛儀 (Life Science)輕輕觸壓大鼠左側(cè)后足第3、4趾間的皮膚，緩慢增加壓力，直至大鼠左側(cè)后足抬起，記錄抬足時(shí)的壓力數(shù)值。如此重復(fù)測(cè)量3次，取平均值為其MWT。

左側(cè)后足足底最大厚度測(cè)量在MWT測(cè)量完畢之后，將大鼠置于塑料瓶中，待其安靜后，固定其左足，使用電子數(shù)顯卡尺 (0～100 mm)測(cè)量左側(cè)后足足底最大厚度 (腹側(cè)至背側(cè))，以評(píng)價(jià)其炎性水腫程度。

Western印跡方法測(cè)定腰段脊髓背角calpain活化和COX-2表達(dá)水平大鼠分別在上述指定時(shí)間點(diǎn)經(jīng)乙醚麻醉、斷頭處死后，提取腰段脊髓背角。大鼠采取俯臥位，剪去背部毛發(fā)，常規(guī)消毒，鋪巾，沿棘突切開(kāi)皮膚及皮下組織，用咬骨鉗分別咬去棘突、椎板，暴露脊髓，小心取出L4-6脊髓，冰上操作(并保持無(wú)菌)，迅速切除制模側(cè)腰段脊髓背角，立即放入液氮保存。提取總蛋白時(shí)將脊髓背角放在勻漿器中，在裂解液中充分勻漿 (始終在冰浴中進(jìn)行)。勻漿好的標(biāo)本取出放入離心管中4℃搖床60 min。然后將勻漿好的標(biāo)本經(jīng)低溫高速 (4℃，12 000×g)離心30 min，取上清液。分裝標(biāo)本-80℃保存。使用Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concerntrate進(jìn)行蛋白定量，通過(guò)Western印跡方法分別檢測(cè)spectrin αⅡ降解產(chǎn)物 (breakdown products，BDP)的含量變化(calpain活化后會(huì)降解spectrin αⅡ，生成相對(duì)分子質(zhì)量為145 000和150 000的片段，通過(guò)對(duì)該條帶的檢測(cè)可以反映calpain的活化程度)及COX-2表達(dá)水平變化?？贵w使用鼠抗 spectrin αⅡ抗體 (Millipore)、兔抗 COX-2抗體 (Santa Cruz Biotechnology，Inc.)和鼠抗 β-actin抗體 (Sigma)。采用 Bandscan軟件對(duì)Western印跡條帶進(jìn)行灰度分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析和Post Hoc檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

對(duì)照組、假手術(shù)組和酵母多糖組大鼠MWT組間MWT基礎(chǔ)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠制模側(cè)后足均未出現(xiàn)明顯的機(jī)械痛敏。酵母多糖組大鼠在制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h制模側(cè)后足對(duì)機(jī)械性刺激的敏感性增強(qiáng)，與對(duì)照組和假手術(shù)組相比MWT明顯降低 (P＜0.05)(表1)。

表1 制模后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、假手術(shù)組和酵母多糖組大鼠機(jī)械刺激縮足閾值比較 (±s，g)Table 1 Mechanical withdrawal threshold of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，g)

表1 制模后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、假手術(shù)組和酵母多糖組大鼠機(jī)械刺激縮足閾值比較 (±s，g)Table 1 Mechanical withdrawal threshold of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，g)

與對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與假手術(shù)組比較，cP＜0.05，dP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group;cP ＜0.05，dP ＜0.01 compared with sham-operated group

組別Group 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h對(duì)照組Control group 54.95±3.18 51.98±6.35 54.00±0.85 54.30±3.11 52.95± 0.78 50.05±0.64 52.75± 1.20 53.10±4.24假手術(shù)組Sham-operated group 53.20±1.56 47.93±8.73 48.13±4.07 49.68±2.83 55.53±10.25 49.85±9.47 50.10±10.75 56.03±4.29酵母多糖組Zymosan group 55.00±3.11 37.48±4.99bc39.78±5.56bc31.08±5.07bd16.45± 9.74bd29.10±6.71ad29.53± 3.80bd33.55±3.51bd

對(duì)照組、假手術(shù)組和酵母多糖組大鼠左側(cè)后足足底最大厚度組間左側(cè)后足足底最大厚度基礎(chǔ)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠左側(cè)后足足底最大厚度均未發(fā)生明顯變化。酵母多糖組大鼠在制模后0.5、1、2、4、8、24、48 h左側(cè)后足足底最大厚度明顯增加，與對(duì)照組和假手術(shù)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)(表2)。

對(duì)照組、假手術(shù)組和酵母多糖組大鼠腰段脊髓背角calpain活化水平酵母多糖組大鼠制模后4、24、48 h腰段脊髓背角內(nèi)spectrin αⅡ BDP的相對(duì)含量分別為265.33±52.11、272.26±44.89、301.65±56.34，與對(duì)照組 (100)和假手術(shù)組 (96.23±15.61)相比均顯著增加 (P＜0.01)，提示酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠腰段脊髓背角內(nèi)calpain活性增強(qiáng) (圖1)。

假手術(shù)組、Z+V組和Z+A組大鼠MWT假手術(shù)組大鼠制模后各時(shí)間點(diǎn)MWT與第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。與假手術(shù)組大鼠制模后相同時(shí)間點(diǎn)比較，Z+V組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MWT均顯著降低 (P＜0.05);Z+A組大鼠制模后0.5、1、2、4、48 h MWT顯著下降 (P＜0.05)，而8 h和24 h MWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。與Z+V組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較，Z+A組大鼠制模后4、8、24、48 h MWT明顯增高 (P＜0.05)(表3)。

假手術(shù)組、Z+V組和Z+A組大鼠左側(cè)后足足底最大厚度假手術(shù)組大鼠制模后各時(shí)間點(diǎn)左側(cè)后足足底最大厚度與第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。與假手術(shù)組大鼠制模后相同時(shí)間點(diǎn)比較，Z+V組大鼠各時(shí)間點(diǎn)左側(cè)后足足底最大厚度均顯著增加 (P＜0.01)，Z+A組大鼠在制模后各時(shí)間點(diǎn)左側(cè)后足足底最大厚度亦顯著增加 (P＜0.05)。但與Z+V組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較，Z+A組大鼠在制模后4、8、24、48 h左側(cè)后足足底最大厚度顯著減小 (P＜0.05)(表4)。

圖1 對(duì)照組、假手術(shù)組、酵母多糖組大鼠制模側(cè)脊髓背角spectrin αⅡ BDP(calpain活化)水平Fig 1 Western blot analysis of spectrin αⅡ BDP(calpain activity)level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn of rats after surgery

表2 制模后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、假手術(shù)組、酵母多糖組大鼠左側(cè)后足足底最大厚度比較 (±s，mm)Table 2 Maximum thickness of the left hind paw of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，mm)

表2 制模后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、假手術(shù)組、酵母多糖組大鼠左側(cè)后足足底最大厚度比較 (±s，mm)Table 2 Maximum thickness of the left hind paw of zymosan-induced inflammatory pain rats compared with control and sham-operated groups at different time points after the surgery(±s，mm)

與對(duì)照組比較，aP＜0.01;與假手術(shù)組比較，bP＜0.01aP＜0.01 compared with control group;bP＜0.01 compared with sham-operated group

Group 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h對(duì)照組Control group 5.07±0.20 5.04±0.15 5.01±0.17 4.99±0.16 5.17±0.20 5.00±0.18 5.07±0.15 5.05±0.22假手術(shù)組Sham-operated group 4.99±0.40 5.72±0.20 5.50±0.25 5.25±0.31 5.24±0.18 5.18±0.11 5.14±0.12 5.49±0.42組別酵母多糖組Zymosan group 5.02±0.41 10.84±0.21ab10.13±0.50ab 9.88±0.54ab10.39±0.35ab 8.89±0.75ab 7.86±0.84ab 7.72±0.38ab

表3 制模后各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組、Z+V組、Z+A組大鼠機(jī)械刺激縮足閾值比較 (±s，g)Table 3 Mechanical withdrawal threshold of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，g)

表3 制模后各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組、Z+V組、Z+A組大鼠機(jī)械刺激縮足閾值比較 (±s，g)Table 3 Mechanical withdrawal threshold of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，g)

DMSO:二甲基亞砜;Z+V:DMSO溶劑對(duì)照組;Z+A:ALLN治療組;與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與Z+V組比較，cP＜0.05DMSO:dimethyl sulphoxide;Z+V:zymosan rats with DMSO treatment;Z+A:zymosan rats with ALLN treatment;aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with sham-operated group;cP＜0.05 compared with Z+V group

?

表4 制模后各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組、Z+V組、Z+A組大鼠左側(cè)后足足底最大厚度比較 (±s，mm)Table 4 Maximum thickness of the left hind paw of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，mm)

表4 制模后各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組、Z+V組、Z+A組大鼠左側(cè)后足足底最大厚度比較 (±s，mm)Table 4 Maximum thickness of the left hind paw of ALLN treated rats compared with sham-operated rats and DMSO treated rats at different time points after the surgery(±s，mm)

與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與Z+V組比較，cP＜0.05aP＜0.05，bP＜0.01 compared with sham-operated group;cP＜0.05 compared with Z+V group

組別Group 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h假手術(shù)組Sham-operated group 5.09±0.24 5.93±0.30 5.55±0.24 5.06±0.65 5.14±0.23 5.02±0.12 5.18±0.33 5.11±0.24 Z+V組Z+V group 4.98±0.24 10.11±0.29b 10.28±0.47b 10.22±0.38b 10.44±0.36b 9.22±0.47b 8.06±0.91b 8.02±0.47b Z+A組Z+A group 5.02±0.33 9.99±0.25b 10.17±0.73b 9.82±0.25b 7.51±0.49bc 6.97±0.57bc 5.99±0.68ac 6.05±0.58

假手術(shù)組、Z+V組、Z+A組大鼠腰段脊髓背角COX-2表達(dá)水平Z+V組大鼠制模后4、24、48 h與假手術(shù)組相比，COX-2表達(dá)水平明顯增加 (P＜0.01);Z+A組大鼠制模后4 h與假手術(shù)組比較，COX-2表達(dá)水平明顯增加 (P＜0.01)，24 h和48 h與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);Z+A組大鼠制模后4、24和48 h與Z+V組相同時(shí)間點(diǎn)比，COX-2表達(dá)水平明顯下降 (P＜0.01)(圖2，表5)。

圖2 假手術(shù)組、Z+V組、Z+V組大鼠制模側(cè)脊髓背角COX-2表達(dá)水平Fig 2 Western blot analysis of COX-2 level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn of rats in sham-operated，Z+V，and Z+A groups

表5 假手術(shù)組、Z+V組、Z+A組大鼠制模側(cè)脊髓背角COX-2表達(dá)水平比較 (±s)Table 5 COX-2 level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn in sham-operated，Z+V，and Z+A groups(±s)

表5 假手術(shù)組、Z+V組、Z+A組大鼠制模側(cè)脊髓背角COX-2表達(dá)水平比較 (±s)Table 5 COX-2 level in the ipsilateral lumbar spinal dorsal horn in sham-operated，Z+V，and Z+A groups(±s)

與假手術(shù)組比較，aP＜0.01;與Z+V組比較，bP＜0.01aP＜0.01 compared with sham-operated group;bP＜0.01 compared with Z+V group

組別Group 4 h 24 h 48 h假手術(shù)組Sham-operated group 100 Z+V組Z+V group 321.34±32.15a 450.65±40.23a165.78±20.18a Z+A組Z+A group 149.43±27.95ab 112.33±18.50b130.46±22.65

討 論

本研究首先通過(guò)在大鼠足底皮下注射酵母多糖1.25 mg制作酵母多糖足底炎性疼痛大鼠模型。結(jié)果顯示，制模后0.5 h開(kāi)始，制模側(cè)后足對(duì)機(jī)械刺激的敏感性增強(qiáng);制模后1、2、4、8、24、48 h各時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛敏仍然存在。炎性水腫特點(diǎn)表現(xiàn)為制模后0.5 h左右開(kāi)始迅速出現(xiàn)的足部水腫，并且持續(xù)超過(guò)48 h。這些特點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［4-5］，證實(shí)制模成功。酵母多糖組大鼠制模后4、24、48 h腰段脊髓背角內(nèi)spectrin αⅡ BDP含量顯著增加，提示酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠外周組織炎性損傷發(fā)生后腰段脊髓背角內(nèi)calpain活性增強(qiáng)。

基于疼痛模型建立的結(jié)果，本研究隨后采用腹腔注射calpain抑制劑ALLN干預(yù)酵母多糖模型大鼠，觀察ALLN的鎮(zhèn)痛作用;同時(shí)觀察ALLN干預(yù)后模型大鼠腰段脊髓背角COX-2表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，ALLN可以顯著緩解酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠制模后4、8、24、48 h的炎性疼痛和炎性水腫，并顯著降低脊髓背角COX-2的表達(dá)，提示calpain抑制劑ALLN可在緩解炎性疼痛和炎性反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。

目前有關(guān)calpain在炎性疼痛方面的研究尚少。已有研究表明，calpain可能通過(guò)降解神經(jīng)微絲蛋白和p35參與炎性疼痛。Kunz等［3］研究顯示，外周炎性損傷發(fā)生后，損傷局部和脊髓水平的calpain活化水平增強(qiáng)，后者通過(guò)降解神經(jīng)微絲蛋白參與疼痛形成;使用calpain抑制劑MDL 28170可以顯著緩解炎性疼痛。Pareek等［6］研究顯示，傷害性神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)有Cdk5和其激活因子p35。當(dāng)外周炎癥發(fā)生后，感覺(jué)神經(jīng)元內(nèi)的calpain活性增強(qiáng)，進(jìn)而降解p35為p25，后者與Cdk5形成更穩(wěn)定的復(fù)合體，使Cdk5活性增加，痛覺(jué)過(guò)敏加劇;通過(guò)抑制calpain活性可以有效緩解痛覺(jué)過(guò)敏。

除參與緩解炎性疼痛外，calpain抑制劑在抑制炎性反應(yīng)、改善缺血性損傷和脊髓損傷等方面的作用也已被大量文獻(xiàn)證實(shí)。有研究表明，calpain抑制劑在抑制急慢性炎癥反應(yīng)方面具有顯著效果［7］。在內(nèi)毒素誘發(fā)的循環(huán)衰竭和多器官功能障礙大鼠模型中，使用calpain抑制劑ALLN可以有效緩解循環(huán)衰竭，并改善肝臟、胰腺功能，緩解乳酸酸中毒和低血糖;同時(shí)降低內(nèi)毒素休克大鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase，iNOS)和 COX-2蛋白的表達(dá)和活性［8］。Calpain抑制劑可以有效緩解脊髓缺血模型大鼠的運(yùn)動(dòng)功能［9］。Calpain抑制劑還可以通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化改善缺血性休克引起的器官功能障礙，同時(shí)抑制NF-κB下游iNOS和COX-2的表達(dá)［10］。

給藥方式和給藥劑量對(duì)疼痛模型的藥物干預(yù)效果有很大影響。有研究顯示，腹腔注射較大劑量calpain抑制劑可以取得與硬膜外腔注射較小劑量calpain抑制劑相同的鎮(zhèn)痛效果，提示calpain抑制劑經(jīng)外周給藥和中樞給藥具有同樣的鎮(zhèn)痛作用，但因?yàn)榻?jīng)中樞給藥的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于經(jīng)外周給藥的劑量，提示calpain抑制劑的鎮(zhèn)痛效果主要是通過(guò)抑制脊髓和背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)calpain的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的［3］。本研究選擇腹腔注射的方式給予ALLN，劑量選擇了文獻(xiàn) ［7］中報(bào)道的可以有效緩解急慢性炎性反應(yīng)的ALLN劑量，獲得了一定的抗炎鎮(zhèn)痛效果。

本研究選擇觀察腰段脊髓背角COX-2的表達(dá)變化主要基于COX-2是外周炎癥發(fā)生后引起脊髓前列腺素E2升高，進(jìn)而擴(kuò)大傷害性感受的主要物質(zhì)［11］。炎性反應(yīng)誘導(dǎo)COX-2表達(dá)后使前列腺素合成釋放增加，后者通過(guò)促進(jìn)傷害性神經(jīng)纖維釋放神經(jīng)遞質(zhì)，以及直接激活位于背角神經(jīng)元上的前列腺素類(lèi)受體，引起外周傷害性神經(jīng)末梢敏化，炎癥局部出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏。同時(shí)，由于脊髓神經(jīng)元興奮性升高，還會(huì)引起其周?chē)磽p傷組織的痛覺(jué)過(guò)敏 (繼發(fā)敏化)。因此測(cè)定脊髓COX-2的表達(dá)水平可以反映痛覺(jué)過(guò)敏的程度［12］。

ALLN治療組大鼠MWT與溶劑對(duì)照組大鼠比較顯著升高，炎性疼痛得到顯著緩解，但仍未恢復(fù)到正常水平，說(shuō)明ALLN干預(yù)只能部分緩解炎性疼痛。外周炎性損傷引起脊髓背角calpain顯著活化后，使用calpain特異性抑制劑ALLN只能部分緩解炎性疼痛可能與以下機(jī)制有關(guān):(1)炎性疼痛的形成和發(fā)展與許多信號(hào)通路密切相關(guān)，除已經(jīng)研究證實(shí)的信號(hào)通路外，還存在許多未知信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，它們均可能對(duì)炎性疼痛的形成和發(fā)展產(chǎn)生影響。因此，單純干預(yù)calpain一條信號(hào)通路并不能完全抑制炎性疼痛;(2)ALLN穿透細(xì)胞膜的能力不十分理想。目前大部分calpain抑制劑都存在細(xì)胞膜通透性相對(duì)較差的問(wèn)題，因此不能完全作用于靶點(diǎn)，充分發(fā)揮抑制作用［13］。對(duì)細(xì)胞膜通透性強(qiáng)的特異性calpain抑制劑的進(jìn)一步研發(fā)將可能解決這一問(wèn)題; (3)ALLN的劑量選擇可能會(huì)影響作用效果，本研究采用的ALLN劑量是根據(jù)文獻(xiàn)中ALLN抑制急慢性炎性反應(yīng)所使用的劑量，也可能存在進(jìn)一步加大劑量會(huì)取得更好效果的可能性。

綜上所述，酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠腰段脊髓背角calpain活化水平顯著增強(qiáng)，通過(guò)腹腔注射calpain抑制劑ALLN可以顯著緩解酵母多糖足底炎性疼痛模型大鼠的炎性疼痛和炎性水腫，同時(shí)顯著降低脊髓背角COX-2的表達(dá)水平。提示calpain活化后可能通過(guò)促進(jìn)脊髓水平COX-2表達(dá)增加，參與炎性疼痛的形成，通過(guò)抑制calpain活性可以有效緩解炎性反應(yīng)及炎性疼痛。

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