洛伐他汀誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌JEC細(xì)胞G1期同步化的研究*

沈慧敏， 李小毛， 楊越波， 王小韻

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

1000-4718(2012)05-0791-05

2011-12-08

2012-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30772332)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 7001568)；廣東省科技計(jì)劃(No.2011B031800056)

△通訊作者 Tel: 020-85252259; E-mail: tigerlee777@163.com

洛伐他汀誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌JEC細(xì)胞G1期同步化的研究*

沈慧敏， 李小毛△， 楊越波， 王小韻

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

目的探討洛伐他汀(Lov)誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌JEC細(xì)胞G1期同步化的方法及JEC細(xì)胞解除G1期同步化后的細(xì)胞周期進(jìn)程。方法CCK-8法測(cè)定JEC細(xì)胞的倍增時(shí)間，采用10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L的Lov，作用1×細(xì)胞倍增時(shí)間進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G1期細(xì)胞的比例，獲得G1期同步化的最佳Lov濃度；采用最佳濃度作用JEC細(xì)胞，于作用后的0.5×倍增時(shí)間～2×倍增時(shí)間內(nèi)，每隔4 h檢測(cè)同步化程度，獲得最佳濃度Lov作用下的最佳同步化時(shí)間；解除G1期同步化，每隔4 h檢測(cè)一次，研究JEC細(xì)胞解除G1期同步化后的細(xì)胞周期進(jìn)程。結(jié)果CCK-8法檢測(cè)顯示JEC細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24 h；JEC細(xì)胞的最佳G1期同步化條件為：20 μmol/L Lov作用24 h，可獲取G1期細(xì)胞(85.00±0.79)%；JEC細(xì)胞于解除G1期同步化后16 h，獲得最大量的S期細(xì)胞，為(45.28±0.53)%；同時(shí)G1期細(xì)胞比例達(dá)到最低，為(35.93±0.44)%。結(jié)論20 μmol/L Lov作用24 h，可獲得大量G1期細(xì)胞；解除G1期同步化后16 h，S期細(xì)胞比例最高，G1期細(xì)胞比例達(dá)到最低，達(dá)到滿意的G1期同步化釋放后效果。

洛伐他?。?JEC細(xì)胞； 細(xì)胞周期； G1期同步化

腫瘤被認(rèn)為是一類細(xì)胞周期性疾病[1-2]，腫瘤發(fā)生的本質(zhì)可能是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞呈自主、不受控、無(wú)限制增殖。腫瘤細(xì)胞周期的研究是目前腫瘤分子生物學(xué)研究中的熱點(diǎn)。在進(jìn)行細(xì)胞周期研究時(shí)通常需要使用細(xì)胞同步化的方法獲得大量處于同一細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞。而根據(jù)研究需要細(xì)胞群所處細(xì)胞周期時(shí)相的不同，細(xì)胞同步化又分為G0/G1期同步化、G1期同步化、G2期同步化、M期同步化和S期同步化。各細(xì)胞周期時(shí)相同步化又有多種方法可供選擇，如需將細(xì)胞同步化于G0/G1期，可采用血清饑餓法、氨基酸饑餓法；如需將細(xì)胞同步化于G1期，多采用洛伐他汀(lovastatin,Lov)或含羞草堿誘導(dǎo)等方法；如需將細(xì)胞同步化于S期，多采用胸腺嘧啶核苷阻滯法。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的同步化研究尚不多見(jiàn)，本研究以人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系JEC細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，探討Lov誘導(dǎo)JEC細(xì)胞G1期同步化的效率及獲取最佳G1期同步化效果的洛伐他汀作用濃度和作用時(shí)間，并進(jìn)一步探討JEC細(xì)胞解除G1期同步化后的細(xì)胞周期進(jìn)程，為研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞JEC為本室保存。細(xì)胞培養(yǎng)基低糖DMEM和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)均為Gibco產(chǎn)品。胰酶為吉諾生物產(chǎn)品。洛伐他汀、甲羥戊酸(mevalonic acid, MVA)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)和核糖核酸酶A (ribonuclease A, RNase A)均為Sigma產(chǎn)品。Cell Counting Kit-8(CCK-8)為同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。FACSCalibur流式細(xì)胞儀為Becton Dickinson產(chǎn)品。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞JEC為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，接種于含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2CCK-8法測(cè)細(xì)胞倍增時(shí)間 取培養(yǎng)的JEC細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)。以含10% FBS的低糖DMEM為培養(yǎng)基，按每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分6組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。接種后將96孔板置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在接種后經(jīng)培養(yǎng)24 h(計(jì)為基點(diǎn)0 h)、40 h(計(jì)為16 h)，之后每隔2～4 h加入CCK-8，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h后上酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)值(檢測(cè)波長(zhǎng)：490 nm；參比波長(zhǎng)：630 nm)，并依據(jù)測(cè)得的A值調(diào)整檢測(cè)時(shí)間間隔，直至A值升至基點(diǎn)時(shí)A值的2倍，此時(shí)的時(shí)間間隔即為該細(xì)胞的倍增時(shí)間。

2.3Lov誘導(dǎo)G1期同步化處理 參照文獻(xiàn)[3]Lov誘導(dǎo)細(xì)胞G1期同步化方法，稍加改進(jìn)，具體操作步驟如下：取培養(yǎng)的JEC細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，以含10% FBS的低糖DMEM為培養(yǎng)基，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，接種后將6孔板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，4組細(xì)胞分別給予10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L Lov作用1×細(xì)胞倍增時(shí)間，收集細(xì)胞進(jìn)行流式分析細(xì)胞周期情況，選取將JEC細(xì)胞同步于G1期百分比最高的Lov濃度，即為G1期同步化最佳Lov濃度；再按上述步驟接種JEC細(xì)胞于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，均加入上述最佳G1期同步化濃度的Lov于培養(yǎng)基中，作用0.5×細(xì)胞倍增時(shí)間～2×細(xì)胞倍增時(shí)間，每隔4 h收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)分析細(xì)胞周期情況，選取在最佳Lov濃度下，將細(xì)胞同步于G1期百分比最高的作用時(shí)間，即為最佳Lov濃度下G1期同步化的最佳時(shí)間。

2.4解除G1期同步化處理 按方法2.3所述步驟接種JEC細(xì)胞于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，均加入上述最佳G1期同步化濃度的Lov于培養(yǎng)基中作用最佳時(shí)間后，吸棄上述含Lov的培養(yǎng)液，PBS洗3次，再加入含MVA(濃度為100倍上述最佳Lov濃度)的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)≥1×細(xì)胞倍增時(shí)間，每隔4 h收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集于離心管中，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，加入70%乙醇1 mL，懸浮細(xì)胞，固定過(guò)夜，檢測(cè)時(shí)1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.5% RNase A 50 μL，混勻，加入450 μL PI染液，避光處2～8 ℃放置30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1CCK-8法測(cè)JEC細(xì)胞倍增時(shí)間

JEC細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)0 h(即基點(diǎn))、16 h、20 h、22 h、24 h和28 h后，其A值分別為：0.3778、0.5829、0.6670、0.6970、0.7423和0.7691。24 h的A值較基點(diǎn)A值增長(zhǎng)了1倍，提示JEC細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24 h。

2Lov誘導(dǎo)JEC細(xì)胞G1期同步化

2.1G1期同步化最佳Lov濃度 4組JEC細(xì)胞分別經(jīng)10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L Lov作用24 h后，G1期細(xì)胞的比例分別為：(81.13±0.70)%、(85.00±0.79)%、(82.62±0.73)%和(82.93±0.56)%，見(jiàn)圖1、2。20 μmol/L Lov作用24 h組G1期細(xì)胞達(dá)到(85.00±0.79)%，較10 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L Lov作用24 h組為高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示Lov誘導(dǎo)JEC細(xì)胞G1期同步化的最佳濃度為20 μmol/L。

Figure 1. Effect of different concentrations of lovastatin (Lov) for 24 h on cell cycle of JEC cells. A: 10 μmol/L Lov;B: 20 μmol/L Lov;C: 30 μmol/L Lov；D: 40 μmol/L Lov.

圖1不同濃度洛伐他汀作用JEC細(xì)胞24h對(duì)細(xì)胞周期的影響

圖2不同濃度洛伐他汀作用JEC細(xì)胞24hG1期細(xì)胞的比例

2.2最佳Lov濃度下G1期同步化最佳作用時(shí)間 JEC細(xì)胞分為10組，每組均加入20 μmol/L Lov，作用12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h和48 h后G1期細(xì)胞的比例分別為：(70.43±1.21)%、(75.46±1.13)%、(82.45±1.09)%、(85.00±0.79)%、(83.02±0.44)%、(80.68±0.45)%、(67.60

±0.62)%、(55.57±0.53)%、(47.78±1.80)%、(50.39±2.12)%，見(jiàn)圖3、4。JEC細(xì)胞經(jīng)20 μmol/L Lov作用24 h組達(dá)到G1期最大同步化，G1期細(xì)胞占(85.00±0.79)%，較20 μmol/L Lov作用12 h、16 h、20 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h和48 h組為高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示JEC細(xì)胞Lov誘導(dǎo)G1期同步化的最佳條件為：20 μmol/L Lov作用24 h。

3JEC細(xì)胞解除G1期同步化后細(xì)胞周期進(jìn)程

JEC細(xì)胞分為8組，每組均采用20 μmol/L Lov同步化作用24 h后，再加入2 mmol/L MVA解除G1期同步化，結(jié)果顯示：JEC細(xì)胞解除G1期同步化后16 h G1期細(xì)胞占比達(dá)到最低，為(35.93±0.44)%，與其它7組(解除G1期同步化后4 h、8 h、12 h、20 h、24 h、28 h和32 h組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；解除G1期同步化16 h后，S期細(xì)胞占比達(dá)到最高，為(45.28±0.53)%，與其它7組(解除G1期同步化后4 h、8 h、12 h、20 h、24 h、28 h和32 h組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1和圖5、6。

Figure 3. Effect of 20 μmol/L lovastatin for different durations on cell cycle of JEC cells. A: 12 h;B: 16 h;C: 20 h;D: 24 h;E: 28 h;F: 32 h;G: 36 h;H: 40 h;I: 44 h;J: 48 h.

圖320μmol/L洛伐他汀作用不同時(shí)間后對(duì)JEC細(xì)胞周期的影響

圖420μmol/L洛伐他汀作用JEC細(xì)胞不同時(shí)間后G1期細(xì)胞的比例

表1JEC細(xì)胞解除G1期同步化后細(xì)胞周期進(jìn)程

GroupG1SG2/M4h76.09±0.5914.45±0.809.46±0.228h67.96±0.2617.57±0.3714.47±0.2212h51.46±1.2732.21±1.1416.33±0.3716h35.93±0.44*45.28±0.53*18.79±0.8720h37.62±0.9939.72±0.9722.66±0.8724h55.91±0.8922.89±0.7121.20±1.4128h72.83±1.6616.36±1.0610.81±1.4032h76.33±1.0017.73±2.145.94±1.15

*P<0.05vsother groups.

Figure 5. Cell cycle progress of JEC cells desynchronized for different durations after induced by 20 μmol/L lovastatin for 24 h.A: 4 h; B: 8 h; C: 12 h; D: 16 h; E: 20 h; F: 24 h; G: 28 h; H: 32 h.

圖520μmol/L洛伐他汀作用24h對(duì)JEC細(xì)胞解除G1期同步化的影響

圖620μmol/L洛伐他汀作用JEC細(xì)胞24h后釋放不同時(shí)間的細(xì)胞周期進(jìn)程

討 論

洛伐他汀抑制HMG-CoA還原酶，導(dǎo)致甲羥戊酸缺乏，而甲羥戊酸是膽固醇合成的前體物質(zhì)，也是p21和Ras的底物異戊烯化所必需的[4]。洛伐他汀能阻滯大部分貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞于G1早期且具有如下優(yōu)點(diǎn)[3,5]：(1)洛伐他汀的同步化作用對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性且可逆，通過(guò)加入甲羥戊酸即可消除其作用；(2)洛伐他汀同步化時(shí)由于不缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與生長(zhǎng)因子，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝失衡；(3)可以獲取大量同步化的G1期細(xì)胞；(4)同步化效率與細(xì)胞種類、細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)基的類型無(wú)關(guān)；(5)可以重復(fù)進(jìn)行同步化。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)用5 μmol/L洛伐他汀作用32 h可使CHO細(xì)胞獲得90%的G1期細(xì)胞；另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)分別用10 μmol/L和20 μmol/L的洛伐他汀作用乳腺癌M6和MCF-1細(xì)胞24 h和33 h，可分別獲得78%和77%～96%的G1期細(xì)胞[7-8]；用10 μmol/L洛伐他汀分別作用24 h和24～48 h可使前列腺癌Pr14和PC-3-M細(xì)胞獲得82%和68%～90%的G1期細(xì)胞[7,9]；用30 μmol/L洛伐他汀干擾膀胱癌T-24細(xì)胞可獲得80% G1期細(xì)胞，對(duì)肺癌Calu-1細(xì)胞則可獲得70%～90%的G1期細(xì)胞[10-11]；還可作用于HL-60、T47D、HELA和U2-OS細(xì)胞，獲得較理想的G1期同步化效應(yīng)[12-17]。在本實(shí)驗(yàn)中使用洛伐他汀對(duì)子宮內(nèi)膜癌JEC細(xì)胞進(jìn)行G1期同步化，首先測(cè)定JEC細(xì)胞的倍增時(shí)間為24 h，符合進(jìn)行細(xì)胞周期同步化的條件，參照Keyomarsi等[5]的洛伐他汀誘導(dǎo)細(xì)胞G1期同步化方法，改進(jìn)如下：先測(cè)定JEC細(xì)胞G1期同步化的最佳洛伐他汀濃度，我們采用4個(gè)濃度梯度：10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L洛伐他汀，作用1×細(xì)胞倍增時(shí)間即24 h，發(fā)現(xiàn)JEC細(xì)胞獲得最大G1期同步化效率的洛伐他汀作用濃度為20 μmol/L，此時(shí)細(xì)胞G1期同步化的程度為(85.00±0.79)%，即為最佳G1期同步化濃度；接下來(lái)研究獲得最佳同步化的洛伐他汀作用時(shí)間，采用上述的最佳濃度作用于JEC細(xì)胞，于作用后的0.5×倍增時(shí)間～2×倍增時(shí)間內(nèi)，每隔4 h檢測(cè)同步化程度，發(fā)現(xiàn)JEC細(xì)胞在上述最佳濃度洛伐他汀作用下的最佳同步化時(shí)間為24 h，此時(shí)G1期同步化的程度為(85.00±0.79)%，得到滿意的同步化效率，由此得出JEC細(xì)胞的最佳G1期同步化條件為：20 μmol/L Lov作用24 h。與文獻(xiàn)比較，本實(shí)驗(yàn)采用洛伐他汀不同濃度梯度結(jié)合不同時(shí)間間隔取樣的同步化方法，更有利于精確地確定洛伐他汀對(duì)所研究細(xì)胞進(jìn)行G1期同步化所能達(dá)到的最大效率。再對(duì)JEC細(xì)胞進(jìn)行解除G1期同步化后細(xì)胞進(jìn)程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)JEC細(xì)胞于釋放后16 h，獲得最大量的S期細(xì)胞，為(45.28±0.53)%；同時(shí)G1期細(xì)胞比例達(dá)到最低，為(35.93±0.44)%，達(dá)到滿意的G1期同步化釋放后效果，可用于開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

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Lovastatin-inducedG1phasesynchronizationinhumanendometrialcancerJECcells

SHEN Hui-min, LI Xiao-mao, YANG Yue-bo, WANG Xiao-yun

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tigerlee777@163.com)

AIM: To investigate the method of inducing G1phase synchronization in human endometrial cancer JEC Cells by lovastatin and the cell cycle progress of JEC cells after desynchronization.METHODSThe doubling time of JEC cells was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. To determine the best lovastatin concentrations for G1synchronization, JEC cells were treated with lovastatin at concentrations of 10, 20, 30 and 40 μmol/L for 1× doubling time, and the cell cycle was detected using flow cytometry (FCM). To determine the best period of lovastatin treatment to achieve G1synchronization, JEC cells were treated with lovastatin at the best concentration for 0.5× to 2× doubling time, and the cell cycle was detected every 4 h using FCM. Furthermore, the cell cycle progress of JEC cells after desynchronization was also observed.RESULTSThe doubling time of JEC cells was almost 24 h. Treatment with lovastatin at the concentration of 20 μmol/L for 24 h achieved maximum G1arrest [(85.00±0.79)%]in JEC cells. Minimum G1phase [(35.93±0.44)%]and maximum S phase [(45.28±0.53)%] were observed after desynchronization for 16 h.CONCLUSIONMaximum G1synchronization of JEC cells is induced by lovastatin at the concentration of 20 μmol/L for 24 h. The JEC cells show minimum G1phase and maximum S phase after desynchronization for 16 h.

Lovastatin; JEC cells; Cell cycle; G1phase synchronization

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.004