小環(huán)肽C* HSDGIC* 對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素人上皮細(xì)胞凋亡的影響*

丁 勇， 程歡歡， 余榕捷， 陳建蘇

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院眼科，2 生物工程研究所，3 醫(yī)學(xué)院眼科研究室，廣東 廣州510632)

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase－activating polypeptide，PACAP)是具有多種重要生物學(xué)功能的神經(jīng)肽，廣泛分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，主要通過(guò)作用于其特異性受體PACAP 1 型受體(PACAP type 1 receptor，PAC1－R)來(lái)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)的功能，這一作用已在視網(wǎng)膜上得到證實(shí)［1］。但PACAP 易被二基肽酶水解生成自身拮抗劑PACAP (6－27)或(6－38)［2］。PACAP 的N 端(His1－Ser2－Asp3－Gly4)是激活PAC1－R 的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域［3］。而小環(huán)肽C*HSDGIC*(CHC)由PACAP N 端5 個(gè)氨基酸經(jīng)二硫鍵環(huán)合而成，穩(wěn)定性較PACAP 更強(qiáng)，是PAC1－R 的新型高效激動(dòng)劑［4］。

在老年性黃斑變性(age－related macular degeneration，AMD)等慢性視網(wǎng)膜疾病中，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的損傷主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡［5］。內(nèi)源性色素水平增高和后極部眼底代謝活動(dòng)增強(qiáng)使得黃斑易受光誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷［6］。Youn 等［7］發(fā)現(xiàn)紫外線(ultraviolet，UV)照射能引起活性氧生成進(jìn)而導(dǎo)致氧化性應(yīng)激，誘導(dǎo)人RPE 細(xì)胞系A(chǔ)RPE－19 凋亡。而Mester 等［8］研究發(fā)現(xiàn)PACAP 對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ARPE－19 凋亡具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究CHC 對(duì)中波紫外線(ultraviolet B，UVB)誘導(dǎo)的人RPE 細(xì)胞凋亡的影響，為RPE 相關(guān)病變的治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

CHC(暨南大學(xué)生物工程研究所余榕捷教授惠贈(zèng));兔源性多克隆PAC1－R 抗體(Santa Cruz);兔單克隆β－actin 抗體(Cell Signaling);山羊抗兔IgG 抗體(Santa Cruz);CCK－8 試劑盒(Donjindo);流式細(xì)胞儀(BD FACSAria TM);全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Tecan Safire2，Switzerland)。

2 方法

2.1 人RPE 細(xì)胞培養(yǎng) RPE 細(xì)胞來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)，第2 ～7 代用于實(shí)驗(yàn)，用含10% FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，3 ～5 d 傳代。

2.2 CCK－8 法檢測(cè) 人RPE 細(xì)胞按5 ×103cells/well 密度于96 孔板鋪板，長(zhǎng)至60%融合的細(xì)胞單層后加入不同濃度CHC，繼續(xù)孵育24 h。另取RPE 細(xì)胞5 ×103cells/well 種于96 孔板，孵育24 h 后，撤去培養(yǎng)基，予0.2 J/cm2UVB (波長(zhǎng)312 nm)照射，隨后實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度CHC 的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，對(duì)照組加入正常無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK－8 溶液，培養(yǎng)2 h，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)450 nm 的吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.3 UVB 照射 紫外燈箱(Spectronics，EBF－260C)內(nèi)進(jìn)行照射，光源距樣品垂直距離15 cm 時(shí)功率為330 μW/cm2。照射時(shí)棄培養(yǎng)基，照后加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 Western blotting 檢測(cè) 收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組1 ×106RPE 細(xì)胞裂解后的上清液，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，PVDF 膜浸入在5%封閉液，4 ℃振蕩1 h，PVDF 膜與兔多克隆PAC1－R 抗體(1∶2 000)和兔單克隆β－actin 抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，再與山羊抗兔IgG 抗體(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL 法顯色，顯影劑孵育1 min，定影劑孵育0.5 min。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 1 ×107/L 細(xì)胞密度種于6孔板，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化3 min，收集細(xì)胞，PBS 吹散制備成單細(xì)胞懸液，收集5 ×105個(gè)細(xì)胞，Annexin V－FITC/PI 雙染:200 μL binding buffer 加入細(xì)胞懸液中，再依次加入10 μL Annexin V－FITC、10 μL PI 輕輕混勻，JC－1 染色:加入200 μL JC－1 稀釋液輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

結(jié) 果

1 CCK－8 法檢測(cè)結(jié)果

圖1 顯示，100 μmol/L CHC 明顯增加人RPE 細(xì)胞活性，100 μmol/L CHC 組比對(duì)照組細(xì)胞活性增加(34.23±3.39)%，差異顯著(P ＜0.05)。除1 nmol/L組外，10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 處理組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

Figure 1. Effects of various concentrations of CHC on the viability of human RPE cells determined by CCK－8 assay.±s. n=12. * P ＜0.05 vs control. CHC:C* HSDGIC* .圖1 不同濃度CHC 對(duì)人RPE 細(xì)胞活性的影響

圖2 顯示，CHC 能抑制UVB 照射誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞活性降低，100 μmol/L 組細(xì)胞活性比UVB 組增高(20.10 ±1.48)%(P ＜0.05)。除1 nmol/L 組外，10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 處理均能使UVB 照射后細(xì)胞活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

Figure 2. Effects of various concentrations of CHC on the viability of human RPE cells after UVB irradiation determined by CCK－8 assay. ±s. n=12. * P ＜0.05 vs UVB.圖2 不同濃度CHC 對(duì)UVB 照射后人RPE 細(xì)胞活性的影響

2 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果

圖3 顯示人RPE 細(xì)胞在正常狀態(tài)下表達(dá)PAC1－R，經(jīng)UVB 照射及CHC 處理后PAC1－R 表達(dá)水平發(fā)生改變。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Annexin V－FITC/PI 雙染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組活細(xì)胞比例為(93.67 ±0.43)%，早期和晚期凋亡細(xì)胞占(5.69 ±0.23)%。經(jīng)0.2 J/cm2UVB 照射后凋亡細(xì)胞比例顯著增加，而100 μmol/L CHC 處理后凋亡細(xì)胞總比例下降(5.63 ±1.49)% (P ＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. Changes of PAC1 receptor (PAC1－R)protein level in human RPE cells treated with 0.2 J/cm2 UVB and in UVB and 100 μmol/L CHC co－treated RPE cells detected by Western blotting. ±s.n =3，* P ＜0.05 vs control，△P ＜0.05 vs UVB.圖3 人RPE 細(xì)胞的PAC1－R 蛋白表達(dá)

Figure 4. Proportion of living，necrotic，early，and late apoptotic cells in untreated control cells，cells exposed to 0.2 J/cm2 UVB irradiation，and cells incubated with 100 μmol/L CHC after UVB treatment. Lower left quadrant:living cells;lower right quadrant:early apoptotic cells;upper left quadrant:necrotic cells;upper right quadrant:late apoptotic cells.圖4 100 μmol/L CHC 對(duì)UVB 照射后RPE 細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例的影響

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位

JC－1 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UVB 照射組低線粒體膜電位細(xì)胞比例顯著增加，而CHC 處理后線粒體去極化細(xì)胞比例下降(5.2 ±0.5)% (P ＜0.05)，表明線粒體途徑可能參與UVB 誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞凋亡，而CHC 能一定程度抑制線粒體膜電位降低，見(jiàn)圖5。

討 論

Figure 5. Effect of CHC (100 μmol/L)on mitochondral membrane potential of human RPE cells after UVB irradiation determined by flow cytometry with JC－1 staining. Lower right quadrant (Q4)indicates cells with mitochondrial depolarization.圖5 100 μmol/L CHC 對(duì)UVB 照射后RPE 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

作為視網(wǎng)膜的最外層，RPE 在胚胎學(xué)上來(lái)自形成感覺(jué)神經(jīng)視網(wǎng)膜的神經(jīng)管。盡管RPE 不直接參與視覺(jué)的神經(jīng)發(fā)生，但對(duì)于光感受器的正常形態(tài)和功能起著關(guān)鍵作用［9］。RPE細(xì)胞的功能包括參與形成血－視網(wǎng)膜屏障，清除代謝廢物，選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)至光感受器，加工維生素A，吞噬光感受器外節(jié)盤(pán)膜，促進(jìn)光感受器更新等。作為AMD 重要的發(fā)病機(jī)制之一，光照損傷通過(guò)造成RPE 細(xì)胞功能障礙而最終導(dǎo)致AMD。大量研究已證明早期AMD(包括玻璃膜疣以及色素改變)與照射暴露之間有顯著相關(guān)性［13］。因而本實(shí)驗(yàn)用紫外照射誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)而研究CHC 對(duì)RPE 細(xì)胞凋亡的影響，以期為AMD 的治療提供新的思路。

在視網(wǎng)膜上，PAC1－R 占PACAP 受體總量的85%，并在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)核層和無(wú)長(zhǎng)突神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá)［10］。Zhang 等［11］用PCR 技術(shù)在RPE 細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)PAC1－R 的mRNA 表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用Western blotting 檢測(cè)出RPE 細(xì)胞上PAC1－R 的蛋白表達(dá)。PAC1－R 通過(guò)作用于多種信號(hào)通路，如抑制線粒體凋亡通路，增加抗凋亡蛋白Bcl－2 表達(dá)和抑制caspase－3 活力來(lái)介導(dǎo)保護(hù)作用，其作用與上述通路開(kāi)放有關(guān)，而非直接依賴于PAC1－R 表達(dá)水平［12］。PAC1－R 的高表達(dá)與組織衰老及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，例如PAC1－R 在老年大鼠的腦部表達(dá)水平隨著年齡增加而顯著升高，與腦部組織衰老程度成正比［15］，又有報(bào)道PAC1－R 在受到輻射及毒素?fù)p傷的胸腺中表達(dá)顯著上調(diào)［16］，這與我們觀察到的PAC1－R 在損傷的細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)相吻合，表明PAC1－R 的表達(dá)與細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)。UVB 照射后PAC1－R 表達(dá)代償性升高，CHC 處理后PAC1－R代償反應(yīng)減弱，表明RPE 細(xì)胞損傷程度降低。PAC1－R 激動(dòng)劑能增加多種細(xì)胞的活性，例如PAC1－R被證實(shí)存在于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSCs)上，其特異激動(dòng)劑能促進(jìn)IPSCs 增殖［14］。有研究證明PACAP具有促進(jìn)RPE 細(xì)胞活性的作用，抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)［11］，10 pmol/L ～1 μmol/L PACAP 能抑制H2O2誘導(dǎo)的ARPE－19 細(xì)胞凋亡［8］。本實(shí)驗(yàn)在UVB 照射后用1 nmol/L ～1 mmol/L CHC 培養(yǎng)RPE細(xì)胞24 h，觀察CHC 對(duì)RPE 細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 處理均能增加UVB 照射后的細(xì)胞活性，抑制凋亡，100 μmol/L CHC 作用最明顯，證明CHC 具有和PACAP 類似的抗凋亡作用。

小環(huán)肽CHC 與PACAP 相比具有以下優(yōu)勢(shì):(1)CHC 由激活PAC1 受體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域HSDGIC 兩端添加半胱氨酸殘基(Cys)經(jīng)二硫鍵環(huán)合而成，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，不易水解，不會(huì)成為自身拮抗劑［4］;(2)CHC結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量小(700 D 左右)，極易穿越血管屏障和其它組織屏障，能更好作用于視網(wǎng)膜組織，在視網(wǎng)膜保護(hù)方面具有應(yīng)用潛能。

綜上，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人RPE 細(xì)胞存在PACAP 的特異受體PAC1－R 的蛋白表達(dá)，并證明由PACAP 衍生而來(lái)的小環(huán)肽C*HSDGIC*對(duì)人RPE 細(xì)胞具有促細(xì)胞活性和抗凋亡的作用。

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