小自噬的研究進展*

陳 艾， 童 煜， 毛 萌△

(1四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科，四川成都610041;2瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，四川瀘州646000)

自噬(autophagy)是繼壞死和凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細胞死亡形式，與疾病的發(fā)生息息相關(guān)，是目前細胞領(lǐng)域研究的熱點之一。自噬是指細胞在自噬相關(guān)基因(autophagy－related gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體/液泡降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程，在進化過程中有高度的保守性。本文就目前小自噬(microautophagy)的研究近況作一綜述。

1 自噬的背景

真菌中與哺乳動物細胞的溶酶體相當(dāng)?shù)募毎鞣Q為液泡(vacuole)。根據(jù)底物進入溶酶體/液泡途徑的不同可將自噬分為3種類型［1－2］:大自噬(macroautophagy)、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone－mediated autophagy，CMA)。自噬的主要功能是保證細胞對底物的再利用，維持細胞的相對穩(wěn)態(tài)［3］。

大自噬即通常所指的自噬，是最主要的自噬形式，其特點是自噬體(autophagosome)的形成［4］。首先，來源不明的游離雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞液或受損的細胞器，形成自噬體。然后，溶酶體/液泡與自噬體融合形成自噬溶酶體，將其內(nèi)容物降解成氨基酸、游離脂肪酸等為細胞重建提供原料，并在機體處于饑餓、營養(yǎng)缺乏等條件下提供能量。

小自噬現(xiàn)象最早由de Duve和Wattiaux在1966年發(fā)現(xiàn)，而其概念直到1983年才被明確［5］。酵母中的小自噬研究比較廣泛和深入，而哺乳動物細胞的小自噬研究較少。一般認為，小自噬分為非選擇性小自噬(nonselective microautophagy，NSM)和選擇性小自噬(selective microautophagy，SM)［6］，前者是指液泡非特異性吞噬蛋白小微?；蚣毎鞒煞?，表現(xiàn)為液泡膜受底物觸發(fā)后發(fā)生管狀內(nèi)陷，底物從內(nèi)陷處被吸入形成小泡［7］。SM的吞噬對象是特定的，如線粒體、細胞核、過氧化物酶體等，表現(xiàn)為哺乳動物的溶酶體膜或植物/真菌等生物的液泡膜與被吞噬底物直接融合，溶酶體膜/液泡膜先向外出現(xiàn)臂膀一樣的突起，將特異性底物攬入其中，再逐漸形成多個內(nèi)陷的小泡，之后小泡完整從膜上的自噬管頂端脫落至膜內(nèi)被降解［3］。小自噬的特點是膜直接形變包裹底物［8］。

CMA為胞漿內(nèi)蛋白底物結(jié)合到分子伴侶后再被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中，分子伴侶主要為熱休克同源蛋白70(70 kD heat－ shock cognate protein，Hsc70)。Hsc70可識別5個氨基酸(賴－苯丙－谷－精－谷酰胺)固定排列的5肽序列(Lys－Phe－Glu－Arg－Gln，KFERQ)，并可與含有此序列的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。KFERQ是可溶性蛋白，Hsc70與之結(jié)合后，再結(jié)合至溶酶體膜上的溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosome－associated membrane protein 2，LAMP －2)，轉(zhuǎn)運到溶酶體內(nèi)降解［9］。

然而最新研究表明，Hsc70－KFERQ－LAMP－2開啟的通路只是分子伴侶介導(dǎo)的一個類型。Hsc70也可以選擇性地與轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體(蛋白質(zhì))分選復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)結(jié)合，開啟一條類似小自噬的途徑，這條途徑被命名為內(nèi)體小自噬(endosomal microautophagy，eMI)［10］。

2 小自噬概述

2．1 小自噬的相關(guān)基因及信號通路 Atg在各類自噬中發(fā)揮作用，不再累述。小自噬的特異基因為“Apg/Aut”通路以及兩類Atg7依賴的泛素樣結(jié)合系統(tǒng)(ubiquitin－like conjugation，Ublc)參與了饑餓誘發(fā)的非選擇性小自噬或者葡萄糖誘發(fā)的選擇性小自噬［11］。在第1個Ublc系統(tǒng)中，Atg8在E1樣酶Atg7和E2樣酶Atg3作用下，經(jīng)過半胱氨酸水解酶的酯化，才能與膜脂質(zhì)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)集合。在第2個Ublc系統(tǒng)，E1樣酶Atg7和E2樣酶Atg10吸引Atg12吸附Atg5，這個Atg12－Atg5二聚體與Atg16寡聚體化，才能促使Atg8－PE復(fù)合物形成［12］。而Atg8－PE復(fù)合物在小泡形成和融合過程中起關(guān)鍵作用。其它特異性基因見后。

2．2 小自噬的功能 小自噬的溶酶體/液泡直接攝取底物并且與其膜融合并內(nèi)吞的過程彌補了大自噬釋放自噬體時丟失的大量膜成分。因此，小自噬是大自噬必要的補充，小自噬產(chǎn)生的小泡(vesicles)在功能上相當(dāng)于大自噬的自噬體。小自噬通過小泡內(nèi)吞的膜成分正好補充大自噬以及CMA形成自噬體釋放的膜成分，這種平衡維持了膜的穩(wěn)態(tài)［13］。但是，這些膜成分在3種自噬之間是如何流通和轉(zhuǎn)換的，目前尚不清楚。

3 小自噬的分類

3．1 eMI 最近，Sahu等［10］鑒定出一種由 ESCRT及Hsc70共同參與，將可溶性胞質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運到內(nèi)體的降解過程。在該研究中，阻斷大自噬過程，可溶性蛋白仍然可以進入內(nèi)體;若同時敲除CMA膜受體LAMP－2A，也不影響內(nèi)體攝取蛋白。通過CMA通路的底物蛋白在攝取之前是完全折疊的，必須先經(jīng)解折疊才能被攝取。而實驗中，溶酶體中的折疊蛋白數(shù)量沒有降低，證明有一條非大自噬也非CMA的自噬通路，于是Sahu等命名這條通路為eMI。

雖然Hsc70沒有任何標(biāo)準區(qū)域與脂質(zhì)蛋白結(jié)合，但是其C端的AA526－539中有一簇可通過靜電作用與磷脂酸結(jié)合，其它兩簇與疏水的氨基酸區(qū)域結(jié)合，有助于將未解折疊的可溶性脂質(zhì)攝入次級內(nèi)體后降解。這種結(jié)合是選擇性的，有的底物不經(jīng)Hsc70也能通過eMI途徑被降解［14］。

eMI發(fā)生依賴于胞內(nèi)多泡體(multivesicular bodies，MVBs)的形成，依賴ESCRT I－III系統(tǒng)的激活及其與底物交聯(lián)。ESCRT－I和ESCRT－II是可溶解于細胞漿的異聚體，ESCRT－III是可溶解于細胞漿的單體，最終3種復(fù)合物均被募集到溶酶體內(nèi)膜形成不能溶解的矩陣，才能形成MVBs需要的微環(huán)境［15］。

ESCRT－I的亞基包括 VPS23、VPS28和 VPS37等，這些亞基被定植于初級內(nèi)體膜的VPS27募集在一起，并與膜內(nèi)磷酸化磷脂酰肌醇結(jié)合，此過程中VPS23與VPS27產(chǎn)生交聯(lián)，激發(fā)ESCRT－I與泛素系統(tǒng)聯(lián)合，激活自噬調(diào)控［16］。ESCRT－I與初級內(nèi)體結(jié)合后才能募集包含VPS22和VPS25的 ESCRT－II形成MVBs通路。MVBs通路開始形成后，已經(jīng)轉(zhuǎn)位在內(nèi)體上的ESCRT－II再吸附胞質(zhì)中的ESCRT－III，至少有6種ESCRT－III亞基存在于酵母中，而在人類至少有10種。3種ESCRT復(fù)合物相互作用，使底物聚集于內(nèi)體膜，同時誘導(dǎo)后者向腔內(nèi)彎曲出芽，最終脫芽產(chǎn)生胞內(nèi)小囊泡，使底物通過MVBs途徑進入內(nèi)體被降解。內(nèi)吞過程執(zhí)行的后期，ESCRT－III必須從ESCRT復(fù)合物上解離以便循環(huán)利用，解離過程由VPS4催化［17］。

以上實驗均提示，小自噬與CMA途徑可能共用一些調(diào)節(jié)因子。在Sahu等的研究基礎(chǔ)上，Santambrogio等［18］總結(jié)了eMI與CMA途徑的主要異同是:eMI途徑的底物為可溶性物質(zhì)，攝入前需為折疊狀，需與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，不經(jīng)LAMP－2A識別，不需GTP供能，最終與次級內(nèi)體(late endosome)融合后被分解并包裹成外體(exosome)，分泌至溶酶體被降解。

CMA途徑的底物攝入前必須解鏈成單體，在LAMP－2A的引導(dǎo)下，消耗ATP及GTP，最終在溶酶體內(nèi)被降解。其共同點為:2條途徑對底物均為直接攝取，都需要KFERQ樣序列及Hsc70的識別，均需消耗ATP酶，見圖1、表1。

Figure 1．The differences between endosomal microautophagy(eMI)and CMA．圖1 內(nèi)體小自噬與分子伴侶小自噬形成的區(qū)別

表1 內(nèi)體小自噬與分子伴侶小自噬的區(qū)別［18］Table 1．The differences between endosomal microautophagy(eMI)and CMA

3．2 非選擇性小自噬 NSM的發(fā)生需要ATP酶以及跨液泡的質(zhì)子梯度;攝取過程需要GTP酶，跨膜電位以及脂肪和膜成分的持續(xù)補充。其調(diào)控因子除了一些自噬相關(guān)蛋白外，還依賴于雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)和EGO蛋白復(fù)合體(exit from rapamycin－induced growth)的結(jié)合，后者由Ego1、Gtr2 及 Ego3 組成［19］。

另一類也在NSM中發(fā)生作用，即液泡轉(zhuǎn)運伴侶(vacuolar transporter chaperone，VTC)復(fù)合物。當(dāng)饑餓、缺氧等應(yīng)激出現(xiàn)時，VTC不均一的分布于液泡膜，富集于內(nèi)陷的自噬微管膜上。VTC復(fù)合物包含3個C端的螺旋狀結(jié)構(gòu):體積較小的VTC1p完全種植于膜內(nèi)，VTC2p、VTC3p/VTC4p復(fù)合物形成一個較大的N端朝向細胞質(zhì)。VTC是自噬微管的主要成分，在小泡從微管上剪切下來時發(fā)揮關(guān)鍵作用。如果VTC變異，自噬微管仍可以形成，但是最終形成的吞噬小泡卻難以被剪切下來［20］。

3．3 酵母研究中發(fā)現(xiàn)的選擇性小自噬

3．3．1 選擇性小自噬的特點 自噬微管的形成是選擇性小自噬區(qū)別于其它自噬的最大特點:(1)小自噬開始時，溶酶體/液泡膜上一些脂質(zhì)從一側(cè)向表面出芽樣突起，進而在一些轉(zhuǎn)膜蛋白協(xié)助下，更多的脂質(zhì)或含有脂質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的蛋白富集，驅(qū)動并參與出芽的過程，此過程需要具有GTP酶活性的Vps1調(diào)控;(2)脂質(zhì)蛋白集落在伸延的同時收縮卷曲，開始朝胞內(nèi)內(nèi)陷，向內(nèi)彎曲形成類圓形、有一定直徑的小管樣結(jié)構(gòu)，稱為“自噬管”(autophagic tube);(3)同時，自噬管形成初期出芽處的蛋白扭結(jié)，成為識別力很強的瓶頸，正是這瓶頸樣結(jié)構(gòu)將自噬管區(qū)別于一般的膜內(nèi)陷;(4)沿著自噬管，細胞內(nèi)膜蛋白迅速松解后向管的頂端排列，這些同源性蛋白以拓撲樣方式編構(gòu)，在ATP功能下逐漸形成小泡，開始小自噬的選擇性吞噬活動［7］。

3．3．2 過氧化物酶體的小自噬(micropexophagy)過氧化物酶體(peroxisome)為真核細胞的一種細胞器。同樣，液泡朝過氧化物酶體伸出突起，這種突起被命名為液泡分離膜(vacuolar sequestering membrane，VSM)，經(jīng)常又被間隔成許多小隔膜［21］。在VSM與過氧化物酶體融合時，帽子形狀的雙層膜結(jié)構(gòu)，稱為過氧化物酶體小自噬特異性膜突起(micropexophagy－ specific membrane apparatus，MIPA)，協(xié)助VSM進行吞噬。MIPA是包裹過氧化物酶體的小泡與液泡接觸時雙層膜處形成的扁平狀小泡，形成于被吞噬小泡的尖端，幫助形成過氧化物酶體自噬體。過氧化物酶體小自噬過程分成3個階段:(1)液泡與過氧化物酶體接近并排，接收成熟過氧化物酶體發(fā)出的信號;(2)回應(yīng)信號，液泡出現(xiàn)膜的內(nèi)陷，凹陷處的邊緣形成并伸出手臂一樣的VSM結(jié)構(gòu)，在MIPA協(xié)助下將過氧化物酶體擁入并內(nèi)吞;(3)在吞噬以后，過氧化物酶體被解離產(chǎn)生氨基酸和脂肪以供細胞循環(huán)再利用。

MIPA的形成與上述過程的實施需要自噬核心基因的完全調(diào)控，以及過氧化物酶體特異性自噬基因，如 Atg11、Atg20、Atg24、Atg25、Atg26、Atg28 和Atg30 的參與［5］。

3．3．3 核的小自噬 (micronucleophagy，piecemeal microautophagy of the nucleus，PMN) PMN 于 2003年被Roberts等［22］發(fā)現(xiàn)，迄今也僅在酵母研究中被描述。指酵母的部分核膜和核質(zhì)內(nèi)陷進入液泡并降解的過程。PMN小泡的包膜有3層，最外層來自于液泡膜，內(nèi)2層來源于核被膜。細胞核通過核泡連接(nucleus－vacuole junction，NVJ)與酵母的液泡接觸。在氮氣或二氧化碳缺乏時，或用雷帕霉素誘導(dǎo)后，NVJ即可產(chǎn)生。

NVJ是一種搭扣樣結(jié)構(gòu)，發(fā)生于液泡膜蛋白Vac8和最外層的核膜蛋白NVJ1之間。在營養(yǎng)缺乏時，NVJ1逐漸與脂肪代謝的2個酶:氧酮結(jié)合蛋白OSH1和輔酶A還原酶TSC13結(jié)合。TSC13為PMN形成所必須的因子之一。OSH1與NVJ1的結(jié)合抑制了絲氨酸與質(zhì)膜的反應(yīng)，從而使NVJ內(nèi)陷形成，釋放裝滿胞核物質(zhì)的小泡到液泡，形成PMN過程［23］。

Dawaliby等［24］研究表明，NVJ在液泡表面形成的屏障在對蛋白開放的同時，偶爾會排斥V－ATP酶，由于PMN過程需要V－ATP酶激活，所以排斥V－ATP酶的屏障只能通過NVJ蛋白家族的成員和其它電化學(xué)成分代謝產(chǎn)生的電位差來釋放小泡，比如OSH1以及TSC13等。所以，NVJ的形成包含2個獨立的步驟:NVJ1和VAC8等富集于核泡兩層膜接觸融合的部位;同時電化學(xué)梯度和酶代謝促使液泡表面形成彌漫的屏障，經(jīng)過如下5個步驟，最終完成PMN過程，如圖2所示［25］。同樣，PMN也需要核心基因的調(diào)控，如 Atg1～Atg10、Atg12～Atg16、Atg18、Atg22等。同時，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)PMN的形成需要特異的Atg蛋白，如 Atg11和Atg17。

Figure 2．Prodecure of piecemeal microautophagy of the nucleus．圖2 核的小自噬形成過程［25］

3．3．4 線粒體小自噬(micromitophagy) 線粒體的吞噬主要通過小自噬途徑［6］。當(dāng)氧化應(yīng)激等情況出現(xiàn)時，線粒體會出現(xiàn)滲透性轉(zhuǎn)移，此過程中，線粒體出現(xiàn)去極化、膨脹等損傷，最終會被降解［26］。不同于其它類別的小自噬，經(jīng)過熒光以及電鏡的觀察，線粒體小自噬分為2種類型:一種類型依賴于Uth1，一種部分定植于線粒體外膜的蛋白，液泡接收到線粒體的信號后慢慢與后者并列，吸引線粒體堆積在其周圍，然后兩者的膜融合產(chǎn)生連接，這種吞噬較精準，只吞噬線粒體而幾乎不會包含其它胞質(zhì)成分。第2種發(fā)現(xiàn)于敲除Uth1的野生型酵母，液泡可直接吞噬線粒體以及其周圍的胞質(zhì)碎片［27］。其特異調(diào)控基因為Atg32。

3．3．5 哺乳動物細胞的小自噬 Glaumann將分離的大鼠肝細胞溶酶體與Percoll顆粒一起孵化，發(fā)現(xiàn)Percoll顆粒被溶酶體吞噬，其過程類似酵母中的MIPA。由于溶酶體膜也出現(xiàn)杯子樣突起去包裹Percoll顆粒，哺乳動物細胞的這類小自噬被稱為溶酶體包裹化(lysosomal wrapping mechanism，LWM)。LWM發(fā)生于各種細胞，如大鼠組織細胞，經(jīng)輻射后的大鼠腎臟巨噬細胞等。LWM發(fā)生時，初級或次級溶酶體會出現(xiàn)變形，由球形拉長，再伸出手臂一樣的突起。目前認為LWM的特點是:(1)在攝取、吞噬和降解過程中需要消耗ATP;(2)LWM的發(fā)生依靠肌纖維的存在;(3)LWM發(fā)生時有蛋白合成［28］。

4 小自噬與疾病

目前已有許多研究證實，小自噬過程出現(xiàn)障礙與許多疾病相關(guān)。如神經(jīng)退行性病變的阿爾茨海默病，以快速進行性癡呆、肌陣攣和特征性腦電圖表現(xiàn)為特點的克－雅病(Creutzfeldt－Jakob disease)，以進行性慢性小腦性共濟失調(diào)為表現(xiàn)的格斯特曼－施特勞斯納(Gerstmann－Straussler－Scheinker，GSS)病，膨脹的MVBs在GSS病人的組織中大量存在。多囊腎、心肌衰弱等也與小自噬有關(guān)。心肌糖原沉積病(Pompe病)也和糖原不能被液泡正常攝取有關(guān)［29］。小自噬與各類疾病的關(guān)系引起人們普遍關(guān)注，研究也正逐漸深入。

5 結(jié)語

目前，小自噬的主要功能被認為是維持細胞器的正常大小，保持膜成分在各類型自噬轉(zhuǎn)換流通中量的平衡，以利于營養(yǎng)剝奪中細胞的存活。根據(jù)攝取底物的不同，小自噬被分為許多亞類型，但其發(fā)生過程基本一致，即膜的融合、小泡的形成、底物被溶酶體或液泡內(nèi)吞降解等步驟。目前國內(nèi)外的研究集中在小自噬的形態(tài)學(xué)方面，在其分子機制及基因調(diào)控，與大自噬以及分子伴侶自噬之間功能的交互等方面尚需要作進一步的研究與總結(jié)。

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